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Encyclopedia of Experiments

Analyse locale de sonde thermique : méthode pour évaluer la nociception des températures élevées chez les larves de Drosophila

Overview

Les larves de drosophiles ont des neurones sensoriels dédiés – les nocicepteurs – dont la réponse aux stimuli thermiques potentiellement nocifs déclenche des comportements aversifs – ou dits « nocifensifs » chez l’animal. Cette vidéo décrit une méthode pour évaluer la nociception thermique en enregistrant le comportement larvaire en réponse à l’application locale d’une sonde thermique sur la cuticule. Cette méthode est donc appelée l’analyse de sonde thermique locale.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Chattopadhyay et coll., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).

1. Analyse locale de sonde de chaleur

Nous livrons un stimulus thermique nocif à un segment individuel de carrosserie larvaire à l’aide d’une sonde thermique sur mesure fabriquée par Pro-Dev Engineering (voir tableau des matériaux). Bien que cette sonde dispose de caractéristiques de conception optimales (une petite pointe métallique de ~ 0,07 mm2 zone et la capacité de maintenir avec précision une température de point fixé de 23 °C à 65 °C) en principe tout outil avec une petite pointe qui peut être chauffé à une température définie pour une période de jusqu’à 20 secondes devrait suffire. La pointe de la sonde est utilisée pour stimuler les larves précocesdu 3e stade précisément sur la ligne médiane dorsale du segment abdominal A4 (voir la figure 1). En réponse à ce stimulus thermique, les larves présentent généralement un comportement de retrait aversif de rouler latéralement de 360 degrés ou plus. Ce comportement est distinct de leur réponse de contact léger à une sonde métallique non nocive de température ambiante qui implique généralement une brève pause dans leur activité locomotrice.

Protocole d’analyse de la sonde thermique :

  1. Température prédéfiguré de la sonde thermique au point d’ensemble désiré.
  2. Utilisez un pinceau ou des forceps pour transférer doucement une larve individuelle sur une plate-forme plate (nous utilisons habituellement un petit morceau de vinyle coupé à partir d’un liant) sur lequel les larves seront ensuite stimulées. La larve doit être recouverte d’un mince film d’eau avant le contact avec la sonde thermique. Le film d’eau couvrant la larve doit être aussi peu que possible et couvrir complètement la larve, tout en s’assurant que la larve n’est pas sèche en touchant le vinyle.
  3. Appuyez doucement sur la pointe de la sonde contre la larve au segment A4 en appliquant une pression lumineuse avec la pointe à environ 45° d’angle entre la sonde et la surface de la larve (voir figure 1). La pression devrait causer une légère indentation à la surface de la larve et sera généralement suffisante pour empêcher la locomotion. Si la larve continue de se déplacer, appliquez un peu plus de pression et elle s’arrêtera habituellement. N’enregistrez pas les données des larves qui se déplacent au-delà du champ de vision ou pour lesquelles un contact constant avec la sonde ne peut être atteint avant la réponse ou le seuil de 20 s.
  4. Continuer à stimuler la larve jusqu’à ce qu’une réponse de retrait soit exposée ou jusqu’à ce que la coupure de 20 secondes soit atteinte, selon la première. Les larves qui réagissent montrent généralement d’abord un comportement préliminaire de levage de la tête et de la queue. Ceci est généralement suivi par le comportement de retrait de rouler au moins 360 degrés. Seul un roulis complet de 360 degrés est marqué comme comportement nocifensive (la tête préliminaire ou la relance de la queue n’est pas).
  5. Une fois que le comportement de retrait est initié contacter la sonde et enregistrer la latence ou le temps de retrait. Si aucun comportement de retrait n’est observé dans les 20 secondes, alors la larve est un non-répondeur. Les intervenants peuvent être divisés en 2 catégories. Si le comportement de retrait est affiché dans les 5 secondes, alors la larve est un répondeur rapide. Si le comportement de retrait est affiché entre 5 et 20 secondes, alors la larve est un répondeur lent (voir la figure 1 dans Babcock et coll., Curr. Biol, c’est lui. (2009)).

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Representative Results

Figure 1
Figure 1 : Installation expérimentale pour l’analyse locale des sondes thermiques. La sonde thermique est contrôlée par une unité de contrôle thermique qui est utilisée pour régler et maintenir la température de la sonde. La sonde est maintenue perpendiculaire à l’axe antéroposterior et utilisée pour stimuler la larve à un angle de 45° par rapport à l’horizontale. Le contact de sonde est fait spécifiquement au segment abdominal A4 comme montré. L’utilisateur doit maintenir ce contact avec une pression douce jusqu’à la coupure de 20 secondes ou jusqu’à ce que le comportement de roulement commence. Si la température est perçue comme nocive, la larve affichera un comportement de retrait aversif caractérisé par au moins un rouleau à 360°. Le nombre de rouleaux peut être simple ou multiple (voir la figure 2B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Quantification de la réponse comportementale à l’aide de l’analyse de la sonde thermique. (A) Parcelle du pourcentage de répondeurs appartenant à chaque catégorie (rapide, lente et non-répondeurs) par rapport à la température. (B) Parcelle de la latence au comportement de retrait aversif par rapport au nombre de rouleaux que chaque larve présentait à quatre températures d’essai différentes de noxiousness croissant (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C et 52 °C). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thermal Probe Pro-Dev Engineering Custom-built on demand Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera Leica Microsystems 12730080 Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope Leica Microsystems Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit Schott AG A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide Schott AG Schott A08575
Thermal Control Unit TSCI corp. Custom Built Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope Carl Zeiss, Inc. NT55-605 Any equivalent microscope will do.
Forceps Fine Science Tools FS-1670
Paintbrush Blick Art Materials 06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish Falcon BD 351008 We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl Office Depot 480009

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Analyse locale de sonde thermique : méthode pour évaluer la nociception des températures élevées chez les larves <em>de Drosophila</em>
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Source : Chattopadhyay, A., et autres méthodes locales et globales d’évaluation de la nociception thermique dans les larves de Drosophila. J. Vis. Exp. (2012).

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