Local Heat Probe Assay: Eine Methode zur Bewertung der Nociception von hohen Temperaturen in Drosophila Larven

Overview

Drosophila-Larven haben spezielle sensorische Neuronen – Nozizeptoren – deren Reaktion auf potenziell schädliche thermische Reize aversive – oder so genannte "nocifensive" Verhaltensweisen im Tier auslöst. Dieses Video beschreibt eine Methode zur Beurteilung der thermischen Nozieption durch Aufzeichnung des Larvenverhaltens als Reaktion auf die lokale Anwendung einer Wärmesonde auf die Nagelhaut. Diese Methode wird daher als Lokalwärmesonde assay bezeichnet.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).

1. Lokale Wärmesonde Assay

Mit einer von Pro-Dev Engineering hergestellten, kundenspezifischen Thermosonde liefern wir einen schädlichen thermischen Stimulus für ein einzelnes Larvenkörpersegment (siehe Materialtabelle). Obwohl diese Sonde über optimale Konstruktionsmerkmale verfügt (eine kleine Metallspitze von 0,07 mm² Fläche und die Möglichkeit, eine Sollwerttemperatur von 23 °C bis 65 °C präzise einzuhalten), sollte grundsätzlich jedes Werkzeug mit einer kleinen Spitze, die für einen Zeitraum von bis zu 20 Sekunden auf eine definierte Temperatur erhitzt werden kann, ausreichen. Die Sondenspitze wird verwendet, um frühe 3^rd instar Larven genau auf der dorsalen Mittellinie im Bauchsegment A4 zu stimulieren (siehe Abbildung 1). Als Reaktion auf diesen thermischen Reiz zeigen Larven in der Regel ein aversives Rückzugsverhalten des seitlichen Rollens um 360 Grad oder mehr. Dieses Verhalten unterscheidet sich von ihrer leichten Berührungsreaktion auf eine nicht-schädliche Raumtemperatur-Metallsonde, die in der Regel eine kurze Pause in ihrer bewegungstreibenden Aktivität beinhaltet.

Protokoll für den Wärmesondentest:

1. Voreingestellte Temperatur der thermischen Sonde auf den gewünschten Sollwert.
2. Verwenden Sie einen Pinsel oder Zange, um eine einzelne Larve sanft auf eine flache Plattform zu übertragen (wir verwenden in der Regel ein kleines Stück Vinyl aus einem Bindemittel geschnitten), auf dem die Larven anschließend stimuliert werden. Die Larve sollte vor dem Kontakt mit der Thermischen Sonde mit einem dünnen Wasserfilm bedeckt werden. Der Wasserfilm, der die Larve bedeckt, sollte so wenig wie möglich sein und die Larve vollständig bedecken, während sichergestellt wird, dass die Larve beim Berühren des Vinyls nicht trocken ist.
3. Drücken Sie vorsichtig die Sondenspitze gegen die Larve im Segment A4, wobei mit der Spitze in etwa einem Winkel von 45° zwischen der Sonde und der Oberfläche der Larve (siehe Abbildung 1) Der Druck sollte einen leichten Einzug auf der Oberfläche der Larve verursachen und in der Regel ausreichen, um Fortbewegung zu verhindern. Wenn sich die Larve weiter bewegt, wenden Sie etwas mehr Druck an und sie wird in der Regel aufhören. Zeichnen Sie keine Daten von Larven auf, die sich über das Sichtfeld hinausbewegen oder für die ein konstanter Sondenkontakt erst nach einer Reaktion oder dem 20-s-Cutoff erreicht werden kann.
4. Die Larve weiter anregen, bis eine Entzugsreaktion angezeigt wird oder bis der 20-Sekunden-Cutoff erreicht ist, je nachdem, was zuerst eintritt. Reagierende Larven zeigen in der Regel zuerst ein vorläufiges Verhalten des Hebens von Kopf und Schwanz. Darauf folgt in der Regel das Rückzugsverhalten von mindestens 360 Grad. Nur eine komplette Rolle von 360 Grad wird als nocifensives Verhalten bewertet (der vorläufige Kopf oder Schwanz erhöhung ist nicht).
5. Sobald das Auszahlungsverhalten initiiert wird, nehmen Sie Kontakt mit der Sonde auf und zeichnen Sie die Latenz oder Zeit bis zum Rückzug auf. Wenn innerhalb von 20 Sekunden kein Entzugsverhalten beobachtet wird, ist die Larve ein Nicht-Responder. Die Responder können weiter in 2 Kategorien eingeteilt werden. Wenn das Entzugsverhalten innerhalb von 5 Sekunden angezeigt wird, dann ist die Larve ein Schnellresponder. Wenn das Entzugsverhalten zwischen 5-20 Sekunden angezeigt wird, dann ist die Larve ein Slow-Responder (siehe Abbildung 1 in Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).

Representative Results

Abbildung 1: Versuchsaufbau für den lokalen Wärmesondentest. Die Wärmesonde wird über eine thermische Steuereinheit gesteuert, die zur Einstellung und Aufrechterhaltung der Temperatur der Sonde verwendet wird. Die Sonde wird senkrecht zur Anteroposteriorachse gehalten und verwendet, um die Larve in einem Winkel von 45° zur Horizontalen zu stimulieren. Der Sondenkontakt erfolgt speziell im Bauchsegment A4, wie gezeigt. Der Anwender muss diesen Kontakt mit sanftem Druck bis zum 20-Sekunden-Cutoff oder bis zum Beginn des Rollverhaltens aufrechterhalten. Wenn die Temperatur als schädlich wahrgenommen wird, zeigt die Larve ein aversives Rückzugsverhalten, das durch mindestens eine 360°-Rolle gekennzeichnet ist. Die Anzahl der Walzen kann einzeln oder mehrfach sein (siehe Abbildung 2B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Quantifizierung der Verhaltensreaktion mit dem Wärmesondentest. (A) Diagramm des Prozentsatzes der Responder, die zu jeder Kategorie (Schnell-, Langsam- und Nicht-Responder) im Vergleich zur Temperatur gehören. (B) Darstellung der Latenz bis zum aversiven Entnahmeverhalten im Vergleich zur Anzahl der Rollen, die jede Larve bei vier verschiedenen Testtemperaturen mit zunehmender Schädlichkeit (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C und 52 °C) aufweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera	Leica Microsystems	12730080	Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope	Leica Microsystems	Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit	Schott AG	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott AG	Schott A08575
Thermal Control Unit	TSCI corp.	Custom Built	Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do.
Forceps	Fine Science Tools	FS-1670
Paintbrush	Blick Art Materials	06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon BD	351008	We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl	Office Depot	480009