Overview
Drosophila 애벌레는 잠재적으로 유해한 열 자극에 대한 반응이 역경을 유발하는 감각 뉴런 -nociceptors -의 전담 감각 뉴런 -또는 소위 "nocifensive"-동물의 행동을 유발합니다. 이 비디오는 큐티클에 열 프로브의 로컬 응용 에 대한 응답으로 애벌레 동작을 기록하여 열 고치름을 평가하는 방법을 설명합니다. 따라서 이 방법은 로컬 열 프로브 분석이라고 합니다.
Protocol
이 프로토콜은 Chattopadhyay 외에서발췌., 드로소필라 애벌레에서 열 노시페션을 평가하는 지역 및 글로벌 방법, J. Vis. Exp. (2012).
1. 로컬 히트 프로브 분석
Pro-Dev Engineering에서 제조한 맞춤형 열 프로브를 사용하여 개별 애벌레 바디 세그먼트에 유해한 열 자극을 제공합니다(재료 표 참조). 이 프로브는 최적의 설계 특징(~ .07 mm2 영역의 작은 금속 팁과 23°C에서 65°C까지 의 세트 포인트 온도를 정밀하게 유지하는 능력)을 가지고 있지만, 원칙적으로 최대 20초 동안 정의된 온도로 가열할 수 있는 작은 팁이 있는 모든 공구는 충분합니다. 프로브 팁은 복부 세그먼트 A4에서 등쪽 미드라인에 정확하게3rd 인스타 애벌레를 자극하는 데 사용됩니다(그림 1참조). 이 열 자극에 응하여, 애벌레는 일반적으로 360도 이상에 의해 말기로 압연의 역경 철수 행동을 전시할 것입니다. 이 동작은 일반적으로 운동 활성에서 잠시 일시 정지를 포함하는 비 유해실온 금속 프로브에 대한 가벼운 터치 반응과 구별됩니다.
열 프로브 분석에 대한 프로토콜 :
- 원하는 설정 점으로 열 프로브의 온도를 미리 설정합니다.
- 페인트 브러시 나 집게를 사용하여 개별 유충을 평평한 플랫폼으로 부드럽게 옮기십시오 (일반적으로 바인더에서 잘라낸 작은 비닐 조각을 사용함)을 유충이 이후에 자극합니다. 유충은 열 프로브와 접촉하기 전에 얇은 물 막으로 덮여있어야합니다. 유충을 덮는 물 필름은 가능한 한 적게 해야 하며 유충을 완전히 덮는 동시에 비닐을 만질 때 유충이 건조하지 않도록 합니다.
- 프로브와 애벌레 표면 사이의 약 45° 각도에서 팁으로 가벼운 압력을 가하는 세그먼트 A4에서 유충에 대한 프로브 팁을 부드럽게 누릅니다(그림 1참조). 압력은 유충의 표면에 약간의 들여쓰기를 일으키는 원인이 되어야 하고 일반적으로 운동을 방지하기 위하여 충분할 것입니다. 애벌레가 계속 움직이면 약간 더 많은 압력을 가하면 일반적으로 중지됩니다. 시야를 넘어 이동하거나 응답 또는 20s 차단될 때까지 일정한 프로브 접촉을 달성할 수 없는 애벌레의 데이터를 기록하지 마십시오.
- 철회 반응이 나타나거나 20초 컷오프가 먼저 발생할 때까지 애벌레를 계속 자극합니다. 반응 애벌레는 일반적으로 먼저 머리와 꼬리를 들어 올리는 예비 행동을 보여줍니다. 이것은 일반적으로 적어도 360도 압연의 철수 행동에 선행됩니다. 360도의 전체 롤만 무분비 동작으로 채점됩니다 (예비 헤드 또는 꼬리 인상은 아닙니다).
- 철수 동작이 시작되면 프로브와의 릴리스 연락처를 시작하고 철회 할 대기 시간 또는 시간을 기록합니다. 20초 이내에 인출 동작이 관찰되지 않으면 유충은 비응답자입니다. 응답자는 2가지 범주로 더 나눌 수 있습니다. 인출 동작이 5초 이내에 표시되면 유충은 빠른 응답자입니다. 인출 동작이 5-20초 사이에 표시되는 경우, 애벌레는 느린 응답자입니다(Babcock 외.,Curr의 그림 1 참조) 바이오엘. (2009)).
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Representative Results
그림 1: 로컬 열 프로브 분석용 실험 설정. 열 프로브는 프로브의 온도를 설정하고 유지하는 데 사용되는 열 제어 장치에 의해 제어됩니다. 프로브는 전방 축에 수직으로 유지되며 수평으로 45° 각도로 애벌레를 자극하는 데 사용됩니다. 프로브 접촉은 도시된 바와 같이 복부 세그먼트 A4에서 구체적으로 만들어집니다. 사용자는 20초 차단 또는 롤링 동작이 시작될 때까지 부드러운 압력으로 이 접촉을 유지해야 합니다. 온도가 유해하다고 인식되면 애벌레는 적어도 하나의 360 ° 롤을 특징으로하는 역행 금단 동작을 보여줍니다. 롤 수는 단일 또는 여러 개일 수 있습니다(그림 2B참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 열 프로브 분석체를 사용하여 행동 반응의 정량화. (A)각 범주에 속하는 응답자의 퍼센트(빠른, 느린 및 비응답자)와 온도에 대한 플롯. (b)각 애벌레가 4개의 상이한 시험 온도에서 나타나는 롤 수에 비해 회향시간의 플롯(42°C, 44°C, 46°C, 48°C, 50°C, 52°C) 및 52°C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 |
