Ensaio da sonda de calor local: um método para avaliar a nocicepção de altas temperaturas em larvas de Drosophila

Overview

As larvas de drosophila têm neurônios sensoriais dedicados – nociceptores – cuja resposta a estímulos térmicos potencialmente prejudiciais desencadeia comportamentos aversivos - ou os chamados "nocifensivos" - comportamentos no animal. Este vídeo descreve um método para avaliar a nocicepção térmica registrando o comportamento larval em resposta à aplicação local de uma sonda de calor na cutícula. Este método é, portanto, chamado de ensaio de sonda de calor local.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Chattopadhyay et al., Métodos Locais e Globais de Avaliação do Nociception Térmico em Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).

1. Ensaio da sonda de calor local

Fornecemos um estímulo térmico nocivo a um segmento de corpo larval individual usando uma sonda térmica personalizada fabricada pela Pro-Dev Engineering (ver Tabela de materiais). Embora esta sonda tenha características de design ótimas (uma pequena ponta metálica de ~ 0,07 mm² área e a capacidade de manter precisamente uma temperatura de ponto definido de 23 °C a 65 °C) em princípio qualquer ferramenta com uma pequena ponta que pode ser aquecida a uma temperatura definida por um período de até 20 segundos deve ser suficiente. A ponta da sonda é usada para estimular as larvas instar 3^ª instar precoces precisamente na linha dorsal no segmento abdominal A4 (ver Figura 1). Em resposta a este estímulo térmico, as larvas geralmente exibirão um comportamento de abstinência aversivo de rolar lateralmente em 360 graus ou mais. Este comportamento é distinto de sua resposta de toque leve a uma sonda metálica de temperatura ambiente não nociva que geralmente envolve uma breve pausa em sua atividade locomotória.

Protocolo para o ensaio da sonda de calor:

1. Temperatura pré-definida da sonda térmica ao ponto de partida desejado.
2. Use um pincel ou fórceps para transferir suavemente uma larva individual para uma plataforma plana (geralmente usamos um pequeno pedaço de vinil cortado de um aglutinante) no qual as larvas serão posteriormente estimuladas. A larva deve ser coberta por uma fina película de água antes do contato com a sonda térmica. O filme de água que cobre a larva deve ser o mínimo possível e cobrir completamente a larva, garantindo que a larva não esteja seca ao tocar o vinil.
3. Pressione suavemente a ponta da sonda contra a larva no segmento A4 aplicando pressão leve com a ponta em cerca de um ângulo de 45° entre a sonda e a superfície da larva (ver Figura 1). A pressão deve causar um leve recuo na superfície da larva e geralmente será suficiente para evitar a locomoção. Se a larva continuar se movendo, aplique um pouco mais de pressão e geralmente vai parar. Não regissão dados de larvas que se movem para além do campo de visão ou para as quais o contato constante da sonda não pode ser alcançado até a resposta ou o corte de 20 s.
4. Continue estimulando a larva até que uma resposta de retirada seja exibida ou até que o corte de 20 segundos seja atingido, o que ocorrer primeiro. As larvas que respondem geralmente mostram primeiro um comportamento preliminar de levantar a cabeça e a cauda. Isso geralmente é seguido pelo comportamento de abstinência de rodar pelo menos 360 graus. Apenas um rolo completo de 360 graus é pontuado como comportamento não-defensivo (o aumento preliminar da cabeça ou da cauda não é).
5. Uma vez iniciado o comportamento de retirada, solte o contato com a sonda e regisse a latência ou o tempo de retirada. Se nenhum comportamento de abstinência for observado dentro de 20 segundos, então a larva é um não-respondente. Os respondentes podem ser divididos em 2 categorias. Se o comportamento de abstinência for mostrado dentro de 5 segundos, então a larva é um rápido respondente. Se o comportamento de abstinência for mostrado entre 5-20 segundos, então a larva é um lento-responder (ver Figura 1 em Babcock et al., Curr. O Biol. (2009)).

Representative Results

Figura 1: Configuração experimental para ensaio de sonda de calor local. A sonda de calor é controlada por uma unidade de controle térmico que é usada para definir e manter a temperatura da sonda. A sonda é mantida perpendicular ao eixo anteroposterior e usada para estimular a larva em um ângulo de 45° para a horizontal. O contato com a sonda é feito especificamente no segmento abdominal A4, como mostrado. O usuário deve manter esse contato com pressão suave até o corte de 20 segundos ou até que o comportamento de rolagem comece. Se a temperatura for percebida como nociva, a larva mostrará um comportamento de abstinência aversivo caracterizado por pelo menos um rolo de 360°. O número de rolos pode ser único ou múltiplo (Ver Figura 2B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação da resposta comportamental usando o ensaio da sonda de calor. (A) Parcela da porcentagem de respondentes pertencentes a cada categoria (rápido, lento e não-respondente) versus temperatura. (B) Parcela da latência ao comportamento de abstinência aversiva versus o número de rolos que cada larva apresentou em quatro diferentes temperaturas de teste de nociva crescente (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C e 52 °C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermal Probe	Pro-Dev Engineering	Custom-built on demand	Contact information can be provided on request
Leica DFC290 12v/400mA Color camera	Leica Microsystems	12730080	Any equivalent camera will do.
Leica MZ6 microscope	Leica Microsystems	Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614
Schott Ace Modulamp Unit	Schott AG	A20500
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide	Schott AG	Schott A08575
Thermal Control Unit	TSCI corp.	Custom Built	Details can be provided on request
Zeiss Stemi 2000 microscope	Carl Zeiss, Inc.	NT55-605	Any equivalent microscope will do.
Forceps	Fine Science Tools	FS-1670
Paintbrush	Blick Art Materials	06762-1002
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish	Falcon BD	351008	We have not tested alternative dishes.
Piece of vinyl	Office Depot	480009