Overview
Drosophila larvaları, potansiyel olarak zararlı termal uyaranlara yanıtı hayvanda aversif veya sözde "nosifensif" davranışları tetikleyen özel duyusal nöronlara -nociceptors- sahiptir. Bu video, bir ısı probunun tiktikül üzerine lokal uygulamasına yanıt olarak larva davranışını kaydederek termal nosiception'ı değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu nedenle, bu yönteme yerel ısı probu tahlili denir.
Protocol
Bu protokol Chattopadhyay ve ark., Drosophila Larvalarında Termal Nociception Değerlendirme Yerel ve Küresel Yöntemlerden bir alıntıdır, J. Vis. Exp. (2012).
1. Yerel Isı Probu Tahlili
Pro-Dev Engineering tarafından üretilen özel yapım bir termal prob kullanarak bireysel larva gövde segmentine zararlı bir termal uyaran sunuyoruz (bkz. Malzeme Tablosu). Bu prob en uygun tasarım özelliklerine sahip olmasına rağmen (~ .07 mm2 alanlı küçük bir metal uç ve 23 °C ila 65 °C arasında ayarlanmış bir nokta sıcaklığını hassas bir şekilde koruma yeteneği) prensip olarak 20 saniyeye kadar tanımlanmış bir sıcaklığa ısıtılabilen küçük uçlu herhangi bir takım yeterli olmalıdır. Prob ucu, erken 3rd instar larvalarını tam olarak karın segmenti A4'teki dorsal orta çizgide uyarmak için kullanılır (bkz. Şekil 1). Bu termal uyarana yanıt olarak, larvalar genellikle yanal olarak 360 derece veya daha fazla yuvarlanma ters bir geri çekilme davranışı sergileyecektir. Bu davranış, genellikle lokomotory aktivitelerinde kısa bir duraklama içeren zararlı olmayan bir oda sıcaklığı metal probuna verdikleri hafif dokunuş tepkisinden farklıdır.
Isı probu tahlil protokolü:
- Termal probun sıcaklığını istenen ayar noktasına önceden ayarlayın.
- Bireysel bir larvayı, larvaların daha sonra uyarılacağı düz bir platforma (genellikle bir bağlayıcıdan kesilmiş küçük bir vinil parçası kullanırız) hafifçe aktarmak için bir boya fırçası veya tokmak kullanın. Larva, termal probla temas kurmadan önce ince bir su filmi ile kaplanmalıdır. Larvaları kaplayan su filmi mümkün olduğunca az olmalı ve larvaları tamamen örtmeli, larvaların vinillere dokunurken kuru olmamasını sağlamalıdır.
- Prob ucunu, prob ile larva yüzeyi arasında yaklaşık 45° açıyla hafif basınç uygulayarak A4 segmentinde larvaya hafifçe bastırın (bkz. Şekil 1). Basınç larva yüzeyinde hafif bir girintiye neden olmalı ve genellikle hareket etmeyi önlemek için yeterli olacaktır. Larva hareket etmeye devam ederse, biraz daha fazla basınç uygulayın ve genellikle durur. Görüş alanının ötesine geçen veya yanıt veya 20 s kesmeye kadar sürekli prob temasının sağlanamadığı larvalardan veri kaydetmeyin.
- Bir geri çekilme yanıtı sergilenene kadar veya 20 saniyelik kesmeye ulaşılana kadar (hangisi önce gerçekleşirse) larvaları uyarmaya devam edin. Yanıt veren larvalar tipik olarak ilk önce başı ve kuyruğu kaldırmanın ön davranışını gösterir. Bunu genellikle en az 360 derece yuvarlanma geri çekilme davranışı izler. Sadece 360 derecelik tam bir rulo nosifensif davranış olarak puanlanır (ön kafa veya kuyruk yükseltmesi değildir).
- Para çekme davranışı başlatıldıktan sonra probla temasa geçin ve geri çekilme süresini veya gecikme süresini kaydedin. 20 saniye içinde geri çekilme davranışı gözlenmezse, larva yanıt vermeyen bir davranıştır. Yanıtlayıcılar ayrıca 2 kategoriye ayrılabilir. Çekilme davranışı 5 saniye içinde gösterilirse, larva hızlı bir yanıt verendir. Geri çekilme davranışı 5-20 saniye arasında gösterilirse, larva yavaş yanıt verendir (Bkz. Babcock ve ark.,Curr'daki Şekil 1. Biol. (2009)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1: Yerel ısı probu tahlilleri için deneysel kurulum. Isı probu, probun sıcaklığını ayarlamak ve korumak için kullanılan bir termal kontrol ünitesi tarafından kontrol edilir. Prob anteroposterior eksene dik tutulur ve larvayı yataya 45 ° 'lik bir açıyla uyarmak için kullanılır. Prob teması özellikle gösterildiği gibi A4 karın segmentinde yapılır. Kullanıcı bu teması 20 saniyelik kesmeye kadar veya yuvarlanma davranışı başlayana kadar hafif bir basınçla korumalıdır. Sıcaklık zararlı olarak algılanırsa, larva en az bir 360 ° rulo ile karakterize edilen averatif bir yoksunluk davranışı gösterecektir. Rulo sayısı tek veya birden çok olabilir (Bkz. Şekil 2B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Isı probu tahlili kullanılarak davranışsal tepkinin ölçülmesi. (A) Her kategoriye ait yanıt verenlerin yüzdesinin (hızlı, yavaş ve yanıt vermeyenler) sıcaklığa karşı çizimi. (B) Her larvanın artan zararlılığın dört farklı test sıcaklığında (42 °C, 44 °C, 46 °C, 48 °C, 50 °C ve 52 °C) sergilenen rulo sayısına kıyasla aversif yoksunluk davranışına gecikmenin arsası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
| Leica DFC290 12v/400mA Color camera | Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
| Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
| Schott Ace Modulamp Unit | Schott AG | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott AG | Schott A08575 | |
| Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Carl Zeiss, Inc. | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
| Forceps | Fine Science Tools | FS-1670 | |
| Paintbrush | Blick Art Materials | 06762-1002 | |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon BD | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
| Piece of vinyl | Office Depot | 480009 |
