Temperaturgradient assay: Eine Methode, um Temperaturpräferenz in Drosophila Larven zu testen

Overview

Drosophila Fruchtfliegen können kleine Temperaturänderungen unterscheiden und daher Umgebungen mit günstigen thermischen Bedingungen auswählen. Dieses Video beschreibt einen Verhaltenstest, der die Temperaturpräferenz von Drosophila-Larven auf einem linearen thermischen Gradienten testet.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Liu et al. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. Temperaturgradienten-Setup

1. Vorbereiten eines einseitigen Farbverlaufs
   1. Um während der Tests eine feuchte Umgebung zu schaffen, legen Sie die beiden Aluminiumblöcke, die mit zwei Wasserbädern verbunden sind, auf nassen Papiertüchern, getrennt durch 10 cm(Abbildung 1A).
   2. Schalten Sie die beiden Wasserbäder 2 h ein, bevor Sie den Test einschalten, damit genügend Zeit für die Temperatur der Aluminiumblöcke ausgeglichen werden kann.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Mock-Experiment durchzuführen, um die Temperatur jedes Wasserbades zu bestimmen, die benötigt wird, um den gewünschten linearen Temperaturgradienten zu erreichen. Einige typische Temperaturpaare zur Einstellung der Wasserbäder sind in Tabelle 1aufgeführt. Beachten Sie jedoch, dass die Oberflächentemperaturen durch die Umgebungstemperatur beeinflusst werden. Die Länge der Schläuche wirkt sich auch auf die Temperaturen aus, da es eine Abkühlung in den Rohren gibt. Die Länge der Schläuche in unserem Setup beträgt 1,5 m.
   3. Mikrowelle 100 ml 1% Agarose bei der Hochleistungseinstellung in einer 500 ml runden Breitmaulflasche und gießen Sie 25 ml/Assay-Platte auf eine ebene Tischplatte. Bereiten Sie zwei Assayplatten vor, die gleichzeitig auf die Aluminiumblöcke gelegt werden können (Abbildung 1A).
   4. Nachdem sich die Agarose verfestigt hat (10-20 min), reiben Sie vorsichtig jede Agarose-Oberfläche mit einem Standard-Küchenschwamm oder einem Melaminschwamm, um die Agarose-Oberfläche leicht grob zu machen, so dass beim Sprühen von Wasser auf das Agarosegel eine glatte dünne Wassermembran entsteht und sich keine Wassertröpfchen bilden.
   5. Untertauchen Sie die Platten vollständig in einen Behälter mit destilliertem Wasser, bis der Test bereit ist, durchgeführt zu werden, um zu verhindern, dass die Platten ausgetrocknet werden.
2. Vorbereiten eines bidirektionalen Farbverlaufs (optional)
   1. Um während der Tests eine feuchte Umgebung zu schaffen, legen Sie drei Aluminiumblöcke im Abstand von 8 cm(Abbildung 1B) auf nasse Papiertücher.
   2. Schalten Sie die beiden Wasserbäder 2 h ein, bevor Sie den Test einschalten, damit genügend Zeit für die Temperatur der Aluminiumblöcke ausgeglichen werden kann.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, ein Mock-Experiment durchzuführen, um die Temperatur jedes Wasserbades für den bidirektionalen Gradienten zu bestimmen. Einige typische Temperaturpaare zur Einstellung der Wasserbäder sind in Tabelle 2aufgeführt. Beachten Sie jedoch, dass die Oberflächentemperaturen durch die Umgebungstemperatur beeinflusst werden. Die Länge der Schläuche wirkt sich auch auf die Temperaturen aus, da es eine Abkühlung in den Rohren gibt. Die Länge der Schläuche in unserem Setup beträgt 1,5 m.
   3. Um zu verhindern, dass die Agarose aus der Platte austritt, wickeln Sie die Kanten der Aluminiumplatte mit Beschriftungsband um, um eine 10 mm hohe Wand zu bilden (Abbildung 1B).
   4. Mit der Hochleistungseinstellung, Mikrowelle 200 ml von 1% Agarose in einer 500 ml runden Breitmaulflasche und gießen 120 ml auf eine Assay-Platte.
   5. Nachdem sich die Agarose verfestigt hat (ca. 30 min), reiben Sie vorsichtig jede Agarose-Oberfläche mit einem Standard-Küchenschwamm oder einem Melaminschwamm, um die Agarose-Oberfläche leicht grob zu machen, so dass beim Sprühen von Wasser auf das Agarosegel eine glatte dünne Wassermembran entsteht und sich keine Wassertröpfchen bilden.
   6. Die Assayplatten vollständig in einen Behälter mit destilliertem Wasser untertauchen, bis der Assay bereit ist, um zu verhindern, dass sie austrocknen.
3. Einrichten eines einseitigen Farbverlaufs
   1. Bereiten Sie Reagenzien und Gegenstände auf einer Bank neben dem Gradienten-Assay-Gerät vor (siehe Materialtabelle).
   2. Um eine effiziente Temperaturübertragung zu fördern, füllen Sie alle Lücken zwischen den Aluminiumblöcken und den Assayplatten, indem Sie Wasser an die Schnittstelle zwischen den Blöcken und der Platte sprühen.
   3. Entfernen Sie mit Handschuhen die Assayplatten aus dem Wasserbehälter. Wenn Wasser zwischen dem Agarose-Gel und der Platte eindringt und beulen an der Oberfläche entstehen lässt, entfernen Sie das Wasser mit einer P1000-Mikropipette.
   4. Legen Sie die Assay-Platten auf die Aluminiumblöcke, so dass die Abgrenzungen, die 2 cm von beiden Kanten entfernt sind, genau mit den Kanten der Aluminiumblöcke übereinstimmen (Abbildung 1A,C).
   5. Sprühen Sie Wasser auf die Oberfläche der Platte (eine dünne Wassermembran, die die Agaroseoberfläche bedeckt), um ein Austrocknen des Agarosegels zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Wassermembran kontinuierlich und frei von Wassertröpfchen ist, da Larven in Wassertröpfchen eingeschlossen werden können.
   6. Bedecken Sie das Gradientensystem mit einem Karton, um die Wasserverdunstung zu reduzieren und die Temperatur der Geloberfläche zu stabilisieren. Warten Sie 5-10 min, damit sich die Temperatur ausdimieren kann.
   7. Überprüfen Sie die Oberflächentemperatur bei 12 Punkten auf der Platte (Abbildung 1C). Führen Sie innerhalb jeder Zone zwei Messungen durch, um festzustellen, ob innerhalb einer Zone eine Variabilität besteht oder nicht. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur an beiden Stellen innerhalb ± 0,2 °C der gewünschten Temperatur liegt.
      HINWEIS: Die Variabilität innerhalb einer Zone tritt in der Regel auf, weil die genauen Abstände der beiden Flecken zum Rand der Aluminiumblöcke nicht identisch sind. Passen Sie die Position der Platte auf den Aluminiumblöcken an, um sicherzustellen, dass die Abgrenzungen, die 2 cm von beiden Kanten entfernt sind, genau mit den Kanten der Aluminiumblöcke übereinstimmen.
   8. Weicht der gemessene Temperaturgradient vom gewünschten Gradienten ab, erhöhen oder verringern Sie die Einstellung(n) der Wasserbadtemperatur und überprüfen Sie die Oberflächentemperatur nach der Temperatur des/der Wasserbad(en) stabilisieren(n).
   9. Bedecken Sie das Gradientensystem mit einem Karton, bis der Test gestartet wird.
4. Einrichten des bidirektionalen Farbverlaufs (optional)
   1. Bereiten Sie Reagenzien und Gegenstände auf einer Bank neben dem Gradienten-Assay-Gerät vor (siehe Materialtabelle).
   2. Sprühen Sie Wasser auf die Oberflächen der drei Aluminiumblöcke, um eine effiziente Temperaturübertragung von den Aluminiumblöcken zu den Assayplatten zu fördern, indem Sie Lücken zwischen den Oberflächen füllen.
   3. Entfernen Sie die Assayplatten vorsichtig aus dem Wasserbehälter und legen Sie sie auf die Aluminiumblöcke. Wenn Wasser zwischen dem Agarose-Gel und der Platte eindringt, was zu Beulen an der Oberfläche führen kann, entfernen Sie das Wasser mit einer P1000-Mikropipette.
   4. Legen Sie die Assayplatte auf die Aluminiumblöcke, so dass die Mittellinien der ersten und letzten Zonen von beiden Kanten genau mit den Kanten der beiden seitlichen Aluminiumblöcke übereinstimmen (Abbildung 1B,D).
   5. Sprühen Sie Wasser auf die Oberfläche der Platte (eine dünne Wassermembran, die die Agaroseoberfläche bedeckt), um ein Austrocknen des Agarosegels zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Wassermembran kontinuierlich und frei von Wassertröpfchen ist, da Larven in Wassertröpfchen gefangen werden können.
   6. Bedecken Sie das Gradientensystem mit einem Karton, um die Wasserverdunstung zu reduzieren und die Temperatur der Geloberfläche zu stabilisieren. Warten Sie 5-10 min, damit sich die Temperatur ausdimieren kann.
   7. Überprüfen Sie die Oberflächentemperatur an zwei Punkten entlang der Mittellinie jeder der 10 Zonen (Abbildung 1D). Führen Sie innerhalb jeder Zone zwei Messungen durch, um festzustellen, ob innerhalb einer Zone eine Variabilität besteht oder nicht. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur an beiden Stellen innerhalb ± 0,2 °C der gewünschten Temperatur liegt.
      HINWEIS: Die Variabilität innerhalb einer Zone tritt in der Regel auf, weil die genauen Abstände der beiden Flecken zum Rand der Aluminiumblöcke nicht identisch sind. Passen Sie die Position der Platte auf den Aluminiumblöcken an, um sicherzustellen, dass die Mittellinien der ersten und letzten Zonen, die jeder Kante am nächsten liegen, genau mit den Kanten der beiden seitlichen Aluminiumblöcke übereinstimmen.
   8. Weicht der gemessene Temperaturgradient vom gewünschten Gradienten ab, stellen Sie die Einstellung der Wasserbadtemperatur(n) ein und überprüfen Sie die Oberflächentemperatur nach der Temperatur des/der Wasserbad(en) stabil(s).
   9. Bedecken Sie die Blöcke mit einem Karton bis zum Beginn des Assays.

2. Assay und Berechnung

1. Entfernen Sie den Karton und überprüfen Sie die Geloberflächentemperatur unmittelbar vor der Übertragung der Larven auf die Platte. Minimieren Sie die Zeit, die der Karton geöffnet ist, um eine Störung des Temperaturgleichgewichts zu verhindern. Wenn die Oberfläche trocken ist, sprühen Sie eine kleine Menge Wasser auf die Oberfläche.
2. Verteilen Sie 150 ± 50 Larven in der Nähe der Mitte jeder Platte (zwischen den Zonen 3 und 4 aus den 6 Zonen) für den eindirektionalen Gradienten (Freisetzungszone; Abbildung 1C).
   HINWEIS: Für den bidirektionalen Gradienten 200-400 Larven entlang der mittleren Zone jeder Hälfte verteilen (Abbildung 1D).
3. Legen Sie einen Mikroplattendeckel über jede Assayplatte, um zu verhindern, dass die Larven herauskriechen. Bedecken Sie das Setup mit einem Karton, um eine Lichtexposition zu verhindern, die sich auf die Larvenwahl auf dem Agaro-Gel auswirken könnte.
   HINWEIS: Für den bidirektionalen Gradienten sollte es nicht notwendig sein, die Platte mit einem Deckel zu bedecken, da die Platte größer ist und die bevorzugte Temperatur der Larven in der mittleren Zone liegt. Folglich sammeln sich nur wenige Larven an den Rändern an und haben die Möglichkeit, herauszukriechen.
4. Lassen Sie den Test für 10-30 min für den eindirektionalen Gradienten und für 15-35 min für den bidirektionalen Gradienten, abhängig vom Alter der Larven , fortfahren (Tabelle 3).
5. Entfernen Sie den Karton und den Mikroplattendeckel. Fotografieren Sie die Platten von oben mit einer Digitalkamera. Nehmen Sie zwei Fotos von jeder Assay-Platte, so dass der Prüfer die mit einem besseren Kontrast und Helligkeit für die Analyse wählen kann.
6. Entfernen Sie alle Larven von den Assayplatten und irgendwo außerhalb der Platten durch Aspiration.
7. Reinigen Sie die Assayplatten, die Schläuche und das Zellsieb gründlich mit destilliertem Wasser. Verwenden Sie die an diesem Tag hergestellten Assayplatten wieder, es sei denn, die Oberfläche der Agarose ist beschädigt.
8. Berechnen Sie die prozentuale Verteilung der Larven in jeder Zone.
   1. Öffnen Sie das fotografische Bild der Testergebnisse mit einer beliebigen Software, die das Hinzufügen von Markierungen zum Bild ermöglicht. Um die Assayzonen anzuzeigen, zeichnen Sie alle 2 cm vertikale Linien basierend auf den Abgrenzungen auf der Assayplatte.
   2. Zählen Sie die Anzahl der Larven in jeder Zone und erfassen Sie die Zahlen. Zählen Sie keine Larven in Regionen 0,5 cm von einer der Wände. Das Gel ist in der Nähe der Wände dicker, und die Oberflächentemperaturen sind in diesen Bereichen nicht linear.
   3. Berechnen Sie für den einseitigen Farbverlauf die prozentuale Verteilung in jeder Zone wie folgt:
      (Anzahl der Larven in einer bestimmten 2-cm-Zone)/ (Gesamtanzahl der Larven in 6 Zonen) x 100.
   4. Berechnen Sie für den bidirektionalen Farbverlauf die prozentuale Verteilung in jeder Zone wie folgt:
      (Anzahl der Larven in einer bestimmten 2-cm-Zone)/ (Gesamtanzahl der Larven in 5 Zonen auf jeder Seite des Farbverlaufs) x 100.

Representative Results

Abbildung 1: Einzel- und bidirektionale Gradienten-Assay-Setups. (A) Einseitiges Gradienten-Setup mit zwei Aluminium-Assayplatten auf zwei Aluminiumblöcken. Die Temperaturen der Aluminiumblöcke werden durch zirkulierendes Wasser aus zwei Wasserbädern gesteuert. (B) Die Anordnung der drei Aluminiumblöcke, Wasserbäder und einer Aluminiumplatte (250 x 220 mm) für einen bidirektionalen Farbverlauf. Der linke und rechte Block sind mit dem gleichen Wasserbad verbunden und der Mittelblock ist mit dem anderen Wasserbad verbunden. Die Aluminium-Assay-Platte ist mit Klebeband umwickelt, um eine 10 mm Wand zu bilden, um die 1% Agarose zu enthalten. (C) Positionen zur Temperaturkontrolle (durch Punkte gekennzeichnet) und zur Freisetzung von Larven auf der Platte. Bevor Sie ein Experiment einieren, überprüfen Sie die Temperatur an zwei Punkten innerhalb jeder Zone, um zu bestätigen, dass der gewünschte lineare Temperaturgradient ermittelt wird. Larven werden innerhalb des angegebenen Bereichs in der Nähe der Mittellinie freigesetzt. Die Larven werden innerhalb jeder der 2-cm-Zonen gezählt. (D) Positionen zur Überprüfung der Temperaturen (durch Punkte gekennzeichnet) und der Freisetzungszonen für die Larven auf einem bidirektionalen Gradienten. Eine gleiche Anzahl von Larven werden entlang der Mittellinie jeder Hälfte des bidirektionalen Gradienten freigesetzt. Die Anzahl der Larven wird in jeder der 10 (2 cm) Zonen gezählt. Ein typischer Temperatursatz (18 °C-26 °C) auf der Agarose-Oberfläche ist angegeben. (E) Temperaturen entlang der Grenzlinien und Mittellinien jeder Zone in einem stichprobenartig gerichteten Gradienten. Die Daten stellen Durchschnittstemperaturen ± SD. n = 8 Assays (150 ± 50 Larven/Assay) dar. Teile dieser Figur werden von Sokabe et al. mit leichten Modifikationen reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Temperaturgradient auf Agaroseplatte (Slope)	Temperaturen der Wasserbäder	Temperaturen von Aluminiumblöcken
10,0-25,0°C (1,5°C/cm)	6,5-7 °C / 28,5 °C	8,5 °C/26,8 °C
18,0-28,0°C (1°C/cm)	16,8 °C/31,0 °C	17,8 °C/ 29,7 °C
14,0-34,0°C (2°C/cm)	10,0 °C/40,0 °C	11,8 °C/ 36,8 °C
12,5-42,0°C (2,95°C/cm)	7,0 °C/55,0 °C	•9,4 °C/ 49,4 °C

Tabelle 1: Typische Temperaturgradienten und die entsprechenden Temperaturen der Wasserbäder und Aluminiumblöcke für einzelne Richtungsverläufe.

Temperaturgradient auf Agaroseplatte	Temperaturen der Wasserbäder	Temperaturen von Aluminiumblöcken
22-10-22°C (1.5°C/cm)	5,0 °C /25,0 °C	7,5 °C/24,0 °C
26-18-26°C (1°C/cm)	15,8 °C / 30,6 °C	16,9 °C/28,4 °C
30-14-30°C (2°C/cm)	8,5 °C / 36,4 °C	10,9 °C/32,8 °C
36-12,5-36°C (2,95°C/cm)	5,0 °C /47,2 °C	7,9 °C/40,9 °C

Tabelle 2: Typische Temperaturgradienten und die entsprechenden Temperaturen der Wasserbäder und Aluminiumblöcke für bidirektionale Gradienten.

Larval Age (AEL)	Assay-Zeit (einzeln)	Assay-Zeit (bidirektional)
24 h	30 Min.	35 Min.
48 h	22 Min.	27 Min.
72 h	16 Min.	21 Min.
96 h	13 Min.	18 Min.
120 h	10 Min.	15 Min.

Tabelle 3: Unterschiedliche Larvenalter (AEL) und die entsprechenden Testzeiten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124