तापमान ढाल परख: ड्रोसोफिला लार्वा में तापमान वरीयता का परीक्षण करने के लिए एक विधि

Overview

ड्रोसोफिला फल मक्खियों तापमान में छोटे परिवर्तनों को अलग कर सकते हैं और इसलिए अनुकूल थर्मल स्थितियों के साथ वातावरण का चयन कर सकते हैं। यह वीडियो एक व्यवहार परख का वर्णन करता है जो एक रैखिक थर्मल ढाल पर ड्रोसोफिला लार्वा की तापमान वरीयता का परीक्षण करता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल लियू एट अल से एक अंश है । ड्रोसोफिला लार्वा, जे विस एक्सप्रेस (2018) की थर्मल वरीयताओं को निर्धारित करने के लिए एक तापमान ढाल परख।

1. तापमान ढाल सेटअप

1. एकल दिशात्मक ढाल तैयार करें
   1. परख के दौरान एक आर्द्र परिवेश वातावरण बनाने के लिए, गीले कागज तौलिए पर दो पानी स्नान से जुड़े दो एल्यूमीनियम ब्लॉक रखें, जो 10 सेमी(चित्रा 1ए)से अलग हो गए हैं।
   2. परख शुरू करने से पहले दो पानी स्नान ~ 2 घंटे चालू करें ताकि एल्यूमीनियम ब्लॉकों के तापमान को बराबरी करने के लिए पर्याप्त समय दिया जा सके।
      नोट: वांछित रैखिक तापमान ढाल प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रत्येक जल स्नान के तापमान को निर्धारित करने के लिए एक नकली प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है। पानी स्नान सेट करने के लिए कुछ विशिष्ट तापमान जोड़े तालिका 1में सूचीबद्ध हैं। हालांकि, ध्यान दें कि सतह का तापमान परिवेश के तापमान से प्रभावित होता है। ट्यूबिंग की लंबाई भी तापमान को प्रभावित करती है क्योंकि ट्यूबों में ठंडा होता है। हमारे सेटअप में टयूबिंग की लंबाई 1.5 मीटर है।
   3. माइक्रोवेव 1% की 100 एमएल एक ५०० मिलीएल गोल चौड़े मुंह की बोतल में उच्च शक्ति सेटिंग पर उठी और एक स्तर बेंचटॉप पर 25 एमएल/परख प्लेट डालना । दो परख प्लेटें तैयार करें, जिन्हें एक ही समय में एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर रखा जासकता है (चित्रा 1ए)।
   4. एगर उठे (10-20 मिनट) के बाद, धीरे-धीरे प्रत्येक उत्पीड़ा सतह को एक मानक रसोई स्पंज या मेलामाइन स्पंज के साथ रगड़ें ताकि एगर उठे हुए सतह पर पानी का छिड़काव थोड़ा मोटा हो सके, ताकि एगर उठे जेल पर पानी का छिड़काव करते समय एक चिकनी पतली पानी की झिल्ली बनाई जा सके, और पानी की कोई बूंद नहीं बनेगी।
   5. पूरी तरह से आसुत पानी के साथ एक कंटेनर में प्लेटों को जलमग्न जब तक परख के लिए प्लेटों को डिसिकेटेड होने से रोकने के लिए प्रदर्शन करने के लिए तैयार है ।
2. एक द्विदिशात्मक ढाल (वैकल्पिक) तैयार करें
   1. परख के दौरान एक आर्द्र परिवेश वातावरण बनाने के लिए, गीले कागज तौलिए पर तीन एल्यूमीनियम ब्लॉक 8 सेमी के अलावा(चित्रा 1बी)रखें।
   2. परख शुरू करने से पहले दो पानी स्नान ~ 2 घंटे चालू करें ताकि एल्यूमीनियम ब्लॉकों के तापमान को बराबरी करने के लिए पर्याप्त समय दिया जा सके।
      नोट: द्विदिशात्मक ढाल के लिए प्रत्येक जल स्नान के तापमान को निर्धारित करने के लिए एक नकली प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है। पानी स्नान सेट करने के लिए कुछ विशिष्ट तापमान जोड़े तालिका 2में सूचीबद्ध हैं। हालांकि, ध्यान दें कि सतह का तापमान परिवेश के तापमान से प्रभावित होता है। ट्यूबिंग की लंबाई भी तापमान को प्रभावित करती है क्योंकि ट्यूबों में ठंडा होता है। हमारे सेटअप में टयूबिंग की लंबाई 1.5 मीटर है।
   3. agarose को प्लेट से बाहर निकलने से रोकने के लिए, एल्यूमीनियम प्लेट के किनारों को लेबलिंग टेप के साथ लपेटें ताकि 10 मिमी ऊंची दीवार(चित्रा 1बी) बनसके।
   4. उच्च शक्ति सेटिंग का उपयोग करना, माइक्रोवेव 1% के माइक्रोवेव 200 एमएल एक 500 मिलीएल गोल चौड़े मुंह की बोतल में उठी और एक परख प्लेट पर 120 मिलीएल डालना।
   5. एगर उठे (~ 30 मिनट) के बाद, धीरे-धीरे प्रत्येक उत्पीड़ा सतह को एक मानक रसोई स्पंज या मेलामाइन स्पंज के साथ रगड़ें ताकि एगर उठे हुए सतह पर पानी का छिड़काव कर सकें, एक चिकनी पतली पानी की झिल्ली बनाई जाती है और पानी की बूंदें नहीं बनती हैं।
   6. पूरी तरह से आसुत पानी के साथ एक कंटेनर में परख प्लेटों जलमग्न जब तक परख के लिए उंहें बाहर सुखाने से रोकने के लिए प्रदर्शन किया जा करने के लिए तैयार है ।
3. एकल दिशात्मक ढाल स्थापित करें
   1. ढाल परख तंत्र के बगल में एक बेंच पर अभिकर् तार और आइटम तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
   2. कुशल तापमान हस्तांतरण को बढ़ावा देने के लिए, ब्लॉक और प्लेट के बीच इंटरफेस पर पानी छिड़काव करके एल्यूमीनियम ब्लॉक और परख प्लेटों के बीच किसी भी अंतराल को भरें।
   3. दस्ताने का उपयोग करना, पानी के कंटेनर से परख प्लेटों को हटा दें। यदि पानी एगर उठे जेल और प्लेट के बीच हमला करता है और सतह पर समान बनाने का कारण बनता है, तो पानी को P1000 माइक्रोपिपेट के साथ हटा दें।
   4. एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर परख प्लेटें रखें ताकि सीमांकन जो या तो किनारे से 2 सेमी हैं, एल्यूमीनियम ब्लॉकों(चित्रा 1ए, सी)के किनारों से बिल्कुल मेल खाते हैं।
   5. प्लेट की सतह पर पानी का छिड़काव करें (एगर उठे सतह को कवर करने वाली एक पतली पानी की झिल्ली पर्याप्त है) एगर उठे जेल को सूखने से रोकने के लिए। सुनिश्चित करें कि पानी की झिल्ली निरंतर और पानी की बूंदों से मुक्त है क्योंकि लार्वा पानी की बूंदों में फंस सकता है।
   6. पानी वाष्पीकरण को कम करने और जेल की सतह के तापमान को स्थिर करने में मदद करने के लिए एक कार्डबोर्ड बॉक्स के साथ ढाल प्रणाली को कवर करें। तापमान को बराबरी करने की अनुमति देने के लिए 5-10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
   7. प्लेट(चित्रा1सी)पर 12 बिंदुओं पर सतह के तापमान की जांच करें। प्रत्येक क्षेत्र के भीतर दो माप लें ताकि यह स्थापित किया जा सके कि किसी क्षेत्र के भीतर परिवर्तनशीलता है या नहीं। सुनिश्चित करें कि दोनों स्थानों पर तापमान वांछित तापमान के ± 0.2 डिग्री सेल्सियस के भीतर है।
      नोट: एक क्षेत्र के भीतर परिवर्तनशीलता आमतौर पर होती है क्योंकि एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारे करने के लिए दो स्थानों की सटीक दूरी समान नहीं हैं। एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर प्लेट की स्थिति को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि या तो किनारे से 2 सेमी सीमांकन एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारों से बिल्कुल मेल खाते हैं।
   8. यदि मापा गया तापमान ढाल वांछित ढाल से भटक जाता है, तो जल स्नान के तापमान की स्थापना (ओं) में वृद्धि या कमी करें और जल स्नान (ओं) के तापमान के स्थिर होने के बाद सतह के तापमान को फिर से जांचें।
   9. परख शुरू करने तक एक कार्डबोर्ड बॉक्स के साथ ढाल प्रणाली को कवर करें।
4. द्विदिशात्मक ढाल (वैकल्पिक) की स्थापना करें
   1. ढाल परख तंत्र के बगल में एक बेंच पर अभिकर् तार और आइटम तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
   2. सतहों के बीच किसी भी अंतराल को भरने के द्वारा एल्यूमीनियम ब्लॉकों से परख प्लेटों के लिए कुशल तापमान हस्तांतरण को बढ़ावा देने के लिए तीन एल्यूमीनियम ब्लॉकों की सतहों पर पानी स्प्रे।
   3. परख प्लेटों को ध्यान से पानी के कंटेनर से निकालें और एल्यूमीनियम ब्लॉक पर जगह है। यदि पानी एगर उठे जेल और प्लेट के बीच हमला करता है, जो सतह पर धक्कों का कारण बन सकता है, तो पी 1000 माइक्रोपिपेट के साथ पानी को हटा दें।
   4. एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर परख प्लेट रखें ताकि दोनों किनारों से पहले और अंतिम क्षेत्रों की मिडलाइन वास्तव में दो तरफ एल्यूमीनियम ब्लॉक(चित्रा 1बी, डी)के किनारों से मेल खाती है।
   5. प्लेट की सतह पर पानी का छिड़काव करें (एगर उठे सतह को कवर करने वाली एक पतली पानी की झिल्ली पर्याप्त है) एगर उठे जेल को सूखने से रोकने के लिए। सुनिश्चित करें कि पानी की झिल्ली निरंतर और पानी की बूंदों से मुक्त है, क्योंकि लार्वा पानी की बूंदों में फंस सकता है।
   6. पानी वाष्पीकरण को कम करने और जेल की सतह के तापमान को स्थिर करने में मदद करने के लिए एक कार्डबोर्ड बॉक्स के साथ ढाल प्रणाली को कवर करें। तापमान को बराबरी करने की अनुमति देने के लिए 5-10 मिनट इंतजार करें।
   7. 10 क्षेत्रों(चित्रा1डी)में से प्रत्येक के मिडलाइन के साथ दो बिंदुओं पर सतह के तापमान की जांच करें । प्रत्येक क्षेत्र के भीतर दो माप लें ताकि यह स्थापित किया जा सके कि किसी क्षेत्र के भीतर परिवर्तनशीलता है या नहीं। सुनिश्चित करें कि दोनों स्थानों पर तापमान वांछित तापमान के ± 0.2 डिग्री सेल्सियस के भीतर है।
      नोट: एक क्षेत्र के भीतर परिवर्तनशीलता आमतौर पर होती है क्योंकि एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारे करने के लिए दो स्थानों की सटीक दूरी समान नहीं हैं। एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर प्लेट की स्थिति को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्येक किनारे के निकटतम पहले और अंतिम क्षेत्रों की मिडलाइन वास्तव में दो तरफ एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारों से मेल खाती है।
   8. यदि मापा गया तापमान ढाल वांछित ढाल से भटक जाता है, तो पानी के स्नान के तापमान की स्थापना (ओं) को समायोजित करें और पानी के स्नान (ओं) के तापमान को स्थिर करने के बाद सतह के तापमान को फिर से जांचें।
   9. परख की शुरुआत तक ब्लॉक को कार्डबोर्ड बॉक्स से कवर करें।

2. परख और गणना

1. कार्डबोर्ड बॉक्स निकालें और प्लेट में लार्वा स्थानांतरित करने से तुरंत पहले जेल सतह के तापमान की जांच करें। तापमान संतुलन को बाधित करने से रोकने के लिए कार्डबोर्ड बॉक्स खुला होने का समय कम से कम करें। यदि सतह सूखी है, तो सतह पर थोड़ी मात्रा में पानी का छिड़काव करें।
2. एकल दिशात्मक ढाल (रिलीज जोन) के लिए प्रत्येक प्लेट के केंद्र के पास 150 ± 50 लार्वा वितरित करें (6 क्षेत्रों में से 3 और 4 क्षेत्रों के बीच); चित्रा 1C)।
   नोट: द्विदिशात्मक ढाल के लिए, प्रत्येक छमाही(चित्रा 1डी)के मध्य क्षेत्र के साथ 200-400 लार्वा वितरित करें।
3. लार्वा को रेंगने से रोकने के लिए प्रत्येक परख प्लेट पर एक माइक्रोप्लेट ढक्कन रखें। प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए एक कार्डबोर्ड बॉक्स के साथ सेटअप को कवर करें, जो एगर उठे जेल पर लार्वा विकल्प को प्रभावित कर सकता है।
   नोट: द्विदिशात्मक ढाल के लिए, प्लेट को ढक्कन से कवर करना आवश्यक नहीं होना चाहिए, क्योंकि प्लेट बड़ी है, और लार्वा का पसंदीदा तापमान मध्य क्षेत्र में है। नतीजतन, कुछ लार्वा किनारों पर जमा होते हैं और उनके पास क्रॉल करने का अवसर होता है।
4. परख को एकल दिशात्मक ढाल के लिए 10-30 मिनट के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें, और लार्वा (तालिका 3) की उम्र के आधार पर द्विदिशात्मक ढाल के लिए15-35मिनट के लिए।
5. गत्ते के बॉक्स और माइक्रोप्लेट ढक्कन को हटा दें। डिजिटल कैमरे का उपयोग करके ऊपर से प्लेटों की तस्वीर लें। प्रत्येक परख प्लेट की दो तस्वीरें लें ताकि अन्वेषक विश्लेषण के लिए बेहतर विपरीत और चमक के साथ एक का चयन कर सके।
6. परख प्लेटों से और आकांक्षा द्वारा प्लेटों के बाहर कहीं भी लार्वा के सभी निकालें।
7. परख प्लेटों, ट्यूबों, और कोशिका छन्नी अच्छी तरह से आसुत पानी के साथ साफ। उस दिन तैयार परख प्लेटों का पुन: उपयोग करें जब तक कि एगर उठी की सतह क्षतिग्रस्त न हो जाए।
8. प्रत्येक जोन में लार्वा के प्रतिशत वितरण की गणना करें।
   1. किसी भी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परख परिणामों की फोटोग्राफिक छवि खोलें जो छवि में चिह्नों को जोड़ने की अनुमति देता है। परख क्षेत्रों को इंगित करने के लिए, परख प्लेट पर सीमांकन के आधार पर हर 2 सेमी ऊर्ध्वाधर रेखाएं खींचें।
   2. प्रत्येक जोन में लार्वा की संख्या गिनें और संख्या रिकॉर्ड करें। किसी भी दीवार से 0.5 सेमी क्षेत्रों में लार्वा की गिनती न करें। जेल दीवारों के पास मोटा है, और सतह का तापमान इन क्षेत्रों में रैखिक नहीं है।
   3. एकल दिशात्मक ढाल के लिए, प्रत्येक क्षेत्र में प्रतिशत वितरण की गणना इस प्रकार है:
      (दिए गए 2-सेमी जोन में लार्वा की संख्या)/(6 जोन में लार्वा की कुल संख्या) x 100।
   4. द्विदिशात्मक ढाल के लिए, प्रत्येक क्षेत्र में प्रतिशत वितरण की गणना इस प्रकार है:
      (दिए गए 2-सेमी जोन में लार्वा की संख्या)/(ढाल के प्रत्येक तरफ 5 क्षेत्रों में लार्वा की कुल संख्या) x 100।

Representative Results

चित्रा 1: एकल और द्विदिशात्मक ढाल परख सेटअप। (क) दो एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर दो एल्यूमीनियम परख प्लेटों के साथ एकल दिशात्मक ढाल सेटअप । एल्यूमीनियम ब्लॉकों के तापमान दो पानी स्नान से पानी परिसंचारी द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं । (ख) एक द्विदिशात्मक ढाल के लिए तीन एल्यूमीनियम ब्लॉक, जल स्नान और एक एल्यूमीनियम प्लेट (२५० x २२० मिमी) की व्यवस्था । बाएं और दाएं ब्लॉक एक ही पानी स्नान से जुड़े होते हैं और मध्य ब्लॉक अन्य जल स्नान से जुड़ा होता है। एल्यूमीनियम परख प्लेट टेप के साथ लपेटा जाता है एक 10 मिमी दीवार बनाने के लिए 1% agarose शामिल हैं । (ग) तापमान (डॉट्स द्वारा इंगित) की जांच करने और प्लेट पर लार्वा छोड़ने की स्थिति। एक प्रयोग शुरू करने से पहले, प्रत्येक क्षेत्र के भीतर दो बिंदुओं पर तापमान की जांच करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि वांछित रैखिक तापमान ढाल स्थापित है। लार्वा मिडलाइन के पास संकेतित क्षेत्र के भीतर जारी किए जाते हैं। लार्वा 2-सेमी क्षेत्रों में से प्रत्येक के भीतर गिना जाता है। (घ) तापमान (डॉट्स द्वारा इंगित) और द्विदिशात्मक ढाल पर लार्वा के लिए रिलीज ज़ोन की जांच करने की स्थिति। द्विदिशात्मक ढाल के प्रत्येक आधे के मिडलाइन के साथ समान संख्या में लार्वा जारी किए जाते हैं। लार्वा की संख्या 10 (2 सेमी) क्षेत्रों में से प्रत्येक में गिनी जाती है। एगरेग् ने सतह पर तापमान (18 डिग्री सेल्सियस-26 डिग्री सेल्सियस) का एक विशिष्ट सेट इंगित किया है। (ङ) प्रत्येक क्षेत्र की सीमा रेखाओं और मिडलाइनों के साथ मापा गया तापमान एकल दिशात्मक ढाल में । डेटा एसडी एन = 8 परख ± मतलब तापमान का प्रतिनिधित्व करते हैं (१५० ± ५० लार्वा/परख) । इस आंकड़े के कुछ हिस्सों को मामूली संशोधनों के साथ सोकाबे एट अल से पुन: पेश किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एगर उठे प्लेट (ढलान) पर तापमान ढाल	पानी स्नान का तापमान	एल्यूमीनियम ब्लॉकों का तापमान
10.0-25.0 डिग्री सेल्सियस (1.5 डिग्री सेल्सियस/सेमी)	~ 6.5-7 डिग्री सेल्सियस/~ 28.5 डिग्री सेल्सियस	~ 8.5 डिग्री सेल्सियस /~ 26.8 डिग्री सेल्सियस
18.0-28.0 डिग्री सेल्सियस (1 डिग्री सेल्सियस/सेमी)	~ 16.8 डिग्री सेल्सियस /~ 31.0 डिग्री सेल्सियस	~ 17.8 डिग्री सेल्सियस /~ 29.7 डिग्री सेल्सियस
14.0-34.0 डिग्री सेल्सियस (2 डिग्री सेल्सियस/सेमी)	~ 10.0 डिग्री सेल्सियस /~ 40.0 डिग्री सेल्सियस	~ 11.8 डिग्री सेल्सियस /~ 36.8 डिग्री सेल्सियस
12.5-42.0 डिग्री सेल्सियस (2.95 डिग्री सेल्सियस/सेमी)	~ 7.0 डिग्री सेल्सियस /~ 55.0 डिग्री सेल्सियस	~ 9.4 डिग्री सेल्सियस /~ 49.4 डिग्री सेल्सियस

तालिका 1: ठेठ तापमान ढाल और एक दिशात्मक ढाल के लिए पानी स्नान और एल्यूमीनियम ब्लॉकों के इसी तापमान।

एगर उठे प्लेट पर तापमान ढाल	पानी स्नान का तापमान	एल्यूमीनियम ब्लॉकों का तापमान
22-10-22 डिग्री सेल्सियस (1.5 डिग्री सेल्सियस/सेमी)	~ 5.0 डिग्री सेल्सियस /~ 25.0 डिग्री सेल्सियस	~ 7.5 डिग्री सेल्सियस /~ 24.0 डिग्री सेल्सियस
26-18-26 डिग्री सेल्सियस (1 डिग्री सेल्सियस/सेमी)	~ 15.8 डिग्री सेल्सियस /~30.6 डिग्री सेल्सियस	~ 16.9 डिग्री सेल्सियस/~ 28.4 डिग्री सेल्सियस
30-14-30 डिग्री सेल्सियस (2 डिग्री सेल्सियस/सेमी)	~ 8.5 डिग्री सेल्सियस /~ 36.4 डिग्री सेल्सियस	~ 10.9 डिग्री सेल्सियस /~ 32.8 डिग्री सेल्सियस
36-12.5-36 डिग्री सेल्सियस (2.95 डिग्री सेल्सियस/सेमी)	~ 5.0 डिग्री सेल्सियस /~ 47.2 डिग्री सेल्सियस	~ 7.9 डिग्री सेल्सियस /~ 40.9 डिग्री सेल्सियस

तालिका 2: विशिष्ट तापमान ढाल और द्विदिशात्मक ढाल के लिए पानी स्नान और एल्यूमीनियम ब्लॉकों के संबंधित तापमान।

लार्वा आयु (एईएल)	परख का समय (एकल दिशात्मक)	परख समय (द्विदिशात्मक)
24 घंटे	30 मिनट	35 मिनट
48 घंटे	22 मिनट	27 मिनट
72 घंटे	16 मिनट	21 मिनट
96 घंटे	13 मिनट	18 मिनट
120 घंटे	10 मिनट	15 मिनट

तालिका 3: विभिन्न लार्वा उम्र (एईएल) और इसी परख समय।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124