Test del gradiente di temperatura: un metodo per testare la preferenza di temperatura nelle larve di Drosophila

Overview

I moscerini della frutta Drosophila possono distinguere piccoli cambiamenti di temperatura e quindi selezionare ambienti con condizioni termiche favorevoli. Questo video descrive un saggio comportamentale che testa la preferenza di temperatura delle larve di Drosophila su un gradiente termico lineare.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Liu et al. Un saggio del gradiente di temperatura per determinare le preferenze termiche delle larve di Drosophila, J. Vis. Exp.

1. Configurazione del gradiente di temperatura

1. Preparare la sfumatura direzionale singola
   1. Per creare un ambiente umido durante i test, posizionare i due blocchi di alluminio collegati a due bagni d'acqua su tovaglioli di carta bagnati, separati da 10 cm(Figura 1A).
   2. Accendere i due bagni d'acqua ~ 2 ore prima di iniziare il test per consentire tempo sufficiente per l'equilibrio della temperatura dei blocchi di alluminio.
      NOTA: Si consiglia di eseguire un finto esperimento per determinare la temperatura di ogni bagno d'acqua necessaria per ottenere il gradiente di temperatura lineare desiderato. Alcune coppie di temperature tipiche per impostare i bagni d'acqua sono elencate nella tabella 1. Tuttavia, si noti che le temperature superficiali sono influenzate dalla temperatura ambiente. La lunghezza dei tubi influisce anche sulle temperature in quanto c'è raffreddamento nei tubi. La lunghezza del tubo nella nostra configurazione è di 1,5 m.
   3. Microonde 100 mL di agarosio all'1% all'impostazione ad alta potenza in una bottiglia rotonda a bocca larga da 500 mL e versare 25 ml / piastra di dosaggio su un banco di livello. Preparare due piastre di dosaggio, che possono essere posizionate contemporaneamente sui blocchi di alluminio (Figura 1A).
   4. Dopo che l'agarosio si è solidificato (10-20 minuti), strofinare delicatamente ogni superficie di agarosio con una spugna da cucina standard o una spugna di melammina per rendere la superficie dell'agarosio leggermente grossolana, in modo che quando si spruzza acqua sul gel di agarosio, venga creata una membrana d'acqua sottile liscia e non si formeranno goccioline d'acqua.
   5. Immergere completamente le piastre in un contenitore con acqua distillata fino a quando il dosaggio non è pronto per essere eseguito per evitare che le piastre si accascino.
2. Preparare una sfumatura bidirezionale (facoltativo)
   1. Per creare un ambiente ambiente umido durante i test, posizionare tre blocchi di alluminio distanti 8 cm(figura 1B)su tovaglioli di carta bagnati.
   2. Accendere i due bagni d'acqua ~ 2 ore prima di iniziare il test per consentire tempo sufficiente per l'equilibrio della temperatura dei blocchi di alluminio.
      NOTA: Si consiglia di eseguire un finto esperimento per determinare la temperatura di ogni bagno d'acqua per il gradiente bidirezionale. Alcune coppie di temperature tipiche per impostare i bagni d'acqua sono elencate nella tabella 2. Tuttavia, si noti che le temperature superficiali sono influenzate dalla temperatura ambiente. La lunghezza dei tubi influisce anche sulle temperature in quanto c'è raffreddamento nei tubi. La lunghezza del tubo nella nostra configurazione è di 1,5 m.
   3. Per evitare che l'agarosio si riversi fuori dalla piastra, avvolgere i bordi della piastra di alluminio con nastro adesivo per formare una parete alta 10 mm(Figura 1B).
   4. Utilizzando l'impostazione ad alta potenza, microonde 200 mL di 1% di agarosio in una bottiglia rotonda a bocca larga da 500 ml e versare 120 mL su una piastra di dosaggio.
   5. Dopo che l'agarosio si è solidificato (~ 30 minuti), strofinare delicatamente ogni superficie di agarosio con una spugna da cucina standard o una spugna di melammina per rendere la superficie dell'agarosio leggermente grossolana, in modo che quando si spruzza acqua sul gel di agarosio, si crea una membrana d'acqua sottile liscia e non si formano goccioline d'acqua.
   6. Immergere completamente le piastre di dosaggio in un contenitore con acqua distillata fino a quando il saggio non è pronto per essere eseguito per evitare che si asciughino.
3. Impostare la sfumatura direzionale singola
   1. Preparare reagenti e oggetti su un banco accanto all'apparato di dosaggio del gradiente (vedere la tabella dei materiali).
   2. Per promuovere un efficiente trasferimento di temperatura, riempire eventuali spazi tra i blocchi di alluminio e le piastre di dosaggio spruzzando acqua all'interfaccia tra i blocchi e la piastra.
   3. Usando i guanti, rimuovere le piastre di dosaggio dal contenitore dell'acqua. Se l'acqua invade tra il gel di agarosio e la piastra e provoca la forma di urti sulla superficie, rimuovere l'acqua con una micropipetta P1000.
   4. Posizionare le piastre di dosaggio sui blocchi di alluminio in modo che le demarcazioni che si trovano a 2 cm da entrambi i bordi corrispondano esattamente ai bordidei blocchi di alluminio (Figura 1A,C).
   5. Spruzzare acqua sulla superficie della piastra (è sufficiente una sottile membrana d'acqua che copre la superficie dell'agarosio) per evitare che il gel di agarosio si asciughi. Assicurati che la membrana dell'acqua sia continua e priva di goccioline d'acqua poiché le larve possono rimanere intrappolate nelle goccioline d'acqua.
   6. Coprire il sistema di gradiente con una scatola di cartone per ridurre l'evaporazione dell'acqua e aiutare a stabilizzare la temperatura della superficie del gel. Attendere 5-10 minuti per consentire alla temperatura di equilibrare.
   7. Controllare la temperatura superficiale a 12 punti sulla piastra(figura 1C). Effettuare due misurazioni all'interno di ciascuna zona per stabilire se esiste o meno variabilità all'interno di una zona. Assicurarsi che la temperatura in entrambi i punti sia ± 0,2 °C della temperatura desiderata.
      NOTA: La variabilità all'interno di una zona di solito si verifica perché le distanze esatte dei due punti sul bordo dei blocchi di alluminio non sono identiche. Regolare la posizione della piastra sui blocchi di alluminio per assicurarsi che le demarcazioni che si trovano a 2 cm da entrambi i bordi corrispondano esattamente ai bordi dei blocchi di alluminio.
   8. Se il gradiente di temperatura misurato si discosta dal gradiente desiderato, aumentare o diminuire le impostazioni della temperatura del bagno d'acqua e ricontrollare la temperatura superficiale dopo che la temperatura dei bagni d'acqua si stabilizza.
   9. Coprire il sistema di gradiente con una scatola di cartone fino ad avviare il saggio.
4. Impostare la sfumatura bidirezionale (facoltativo)
   1. Preparare reagenti e oggetti su un banco accanto all'apparato di dosaggio del gradiente (vedere la tabella dei materiali).
   2. Spruzzare acqua sulle superfici dei tre blocchi di alluminio per promuovere un efficiente trasferimento di temperatura dai blocchi di alluminio alle piastre di dosaggio riempiendo eventuali spazi tra le superfici.
   3. Rimuovere accuratamente le piastre di dosaggio dal contenitore dell'acqua e posizionarsi sui blocchi di alluminio. Se l'acqua invade tra il gel di agarosio e la piastra, che potrebbe causare la formare dossi sulla superficie, rimuovere l'acqua con una micropipetta P1000.
   4. Posizionare la piastra di dosaggio sui blocchi di alluminio in modo che le linee medie della prima e dell'ultima zona da entrambi i bordi corrispondano esattamente ai bordi dei due blocchi laterali dialluminio (Figura 1B,D).
   5. Spruzzare acqua sulla superficie della piastra (è sufficiente una sottile membrana d'acqua che copre la superficie dell'agarosio) per evitare che il gel di agarosio si asciughi. Assicurati che la membrana dell'acqua sia continua e priva di goccioline d'acqua, poiché le larve possono rimanere intrappolate nelle goccioline d'acqua.
   6. Coprire il sistema di gradiente con una scatola di cartone per ridurre l'evaporazione dell'acqua e aiutare a stabilizzare la temperatura della superficie del gel. Attendere 5-10 minuti per consentire alla temperatura di equilibrare.
   7. Controllare la temperatura superficiale in due punti lungo la linea mediana di ciascuna delle 10 zone (Figura 1D). Effettuare due misurazioni all'interno di ciascuna zona per stabilire se esiste o meno variabilità all'interno di una zona. Assicurarsi che la temperatura in entrambi i punti sia ± 0,2 °C della temperatura desiderata.
      NOTA: La variabilità all'interno di una zona di solito si verifica perché le distanze esatte dei due punti sul bordo dei blocchi di alluminio non sono identiche. Regolare la posizione della piastra sui blocchi di alluminio per assicurarsi che le linee medie della prima e dell'ultima zona più vicine a ciascun bordo corrispondano esattamente ai bordi dei due blocchi laterali di alluminio.
   8. Se il gradiente di temperatura misurato si discosta dal gradiente desiderato, regolare le impostazioni della temperatura del bagno d'acqua e ricontrollare la temperatura superficiale dopo che la temperatura dei bagni d'acqua si stabilizza.
   9. Coprire i blocchi con una scatola di cartone fino all'inizio del saggio.

2. Saggio e calcolo

1. Rimuovere la scatola di cartone e controllare la temperatura della superficie del gel immediatamente prima di trasferire le larve sulla piastra. Ridurre al minimo il tempo di apertura della scatola di cartone per evitare di interrompere l'equilibrazione della temperatura. Se la superficie è asciutta, spruzzare una piccola quantità di acqua sulla superficie.
2. Distribuire 150 ± 50 larve vicino al centro di ogni piastra (tra le zone 3 e 4 delle 6 zone) per il gradiente direzionale singolo (zona di rilascio; Figura 1C).
   NOTA: Per il gradiente bidirezionale, distribuire 200-400 larve lungo la zona centrale di ogni metà (Figura 1D).
3. Posizionare un coperchio in micropiastra su ogni piastra di dosaggio per evitare che le larve strisciano fuori. Coprire la configurazione con una scatola di cartone per evitare l'esposizione alla luce, che potrebbe influire sulla scelta larvale sul gel di agarosio.
   NOTA: Per il gradiente bidirezionale, non dovrebbe essere necessario coprire la piastra con un coperchio, perché la piastra è più grande e la temperatura preferita delle larve è nella zona centrale. Di conseguenza, poche larve si accumulano ai bordi e hanno l'opportunità di strisciare fuori.
4. Lasciare che il saggio proceda per 10-30 minuti per il gradiente monodirezionale e per 15-35 minuti per il gradiente bidirezionale, a seconda dell'età delle larve(Tabella 3).
5. Rimuovere la scatola di cartone e il coperchio della micropiatta. Fotografare le lastre dall'alto utilizzando una fotocamera digitale. Scatta due fotografie di ogni piastra di dosaggio in modo che l'investigatore possa scegliere quella con un migliore contrasto e luminosità per l'analisi.
6. Rimuovere tutte le larve dalle piastre di dosaggio e ovunque al di fuori dei piatti per aspirazione.
7. Pulire accuratamente le piastre di dosaggio, i tubi e il filtro cellulare con acqua distillata. Riutilizzare le piastre di dosaggio preparate quel giorno a meno che la superficie dell'agarosio non sia danneggiata.
8. Calcola la distribuzione percentuale delle larve in ogni zona.
   1. Aprire l'immagine fotografica dei risultati del saggio utilizzando qualsiasi software che consenta di aggiungere marcature all'immagine. Per indicare le zone di dosaggio, disegnare linee verticali ogni 2 cm in base alle demarcazioni sulla piastra di dosaggio.
   2. Contare il numero di larve in ogni zona e registrare i numeri. Non contare le larve nelle regioni a 0,5 cm da nessuna delle pareti. Il gel è più spesso vicino alle pareti e le temperature superficiali non sono lineari in queste regioni.
   3. Per il gradiente direzionale singolo, calcolare la distribuzione percentuale in ogni zona come segue:
      (numero di larve in una data zona di 2 cm)/ (numero totale di larve in 6 zone) x 100.
   4. Per il gradiente bidirezionale, calcolare la distribuzione percentuale in ogni zona come segue:
      (numero di larve in una determinata zona di 2 cm)/ (numero totale di larve in 5 zone su ciascun lato del gradiente) x 100.

Representative Results

Figura 1: Configurazioni di test del gradiente singolo e bidirezionale. (A) Configurazione a gradiente direzionale singolo con due piastre di dosaggio in alluminio su due blocchi di alluminio. Le temperature dei blocchi di alluminio sono controllate dall'acqua circolante da due bagni d'acqua. (B) La disposizione dei tre blocchi di alluminio, dei bagni d'acqua e di una piastra di alluminio (250 x 220 mm) per un gradiente bidirezionale. I blocchi sinistro e destro sono collegati allo stesso bagno d'acqua e il blocco centrale è collegato all'altro bagno d'acqua. La piastra di dosaggio in alluminio è avvolta con nastro adesivo per formare una parete da 10 mm per contenere l'1% di agarosio. (C) Posizioni per controllare le temperature (indicate dai punti) e rilasciare le larve sul piatto. Prima di iniziare un esperimento, controllare la temperatura in due punti all'interno di ciascuna zona per confermare che viene stabilito il gradiente di temperatura lineare desiderato. Le larve vengono rilasciate all'interno dell'area indicata vicino alla linea mediana. Le larve sono contate all'interno di ciascuna delle zone di 2 cm. (D) Posizioni per controllare le temperature (indicate dai punti) e le zone di rilascio per le larve su un gradiente bidirezionale. Un numero uguale di larve viene rilasciato lungo la linea mediana di ogni metà del gradiente bidirezionale. Il numero di larve viene conteggiato in ciascuna delle zone di 10 (2 cm). È indicato un tipico insieme di temperature (18 °C-26 °C) sulla superficie dell'agarosio. (E) Temperature misurate lungo le linee di confine e le linee medie di ciascuna zona in un gradiente monodirezionale campione. I dati rappresentano temperature medie ± SD. n = 8 test (150 ± 50 larve /saggio). Parti di questa figura sono riprodotte da Sokabe et al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gradiente di temperatura sulla piastra di agarosio (pendenza)	Temperature dei bagni d'acqua	Temperature dei blocchi di alluminio
10,0-25,0°C (1,5°C/cm)	~6,5-7°C/~28,5°C	~8,5°C/~26,8°C
18,0-28,0°C (1°C/cm)	~16,8°C/~31,0°C	~17,8°C/~29,7°C
14,0-34,0°C (2°C/cm)	~10,0°C/~40,0°C	~11,8°C/~36,8°C
12,5-42,0°C (2,95°C/cm)	~7,0°C/~55,0°C	~9,4°C/~49,4°C

Tabella 1: Gradienti di temperatura tipici e temperature corrispondenti dei bagni d'acqua e dei blocchi di alluminio per pendenze direzionali singole.

Gradiente di temperatura sulla piastra di agarosio	Temperature dei bagni d'acqua	Temperature dei blocchi di alluminio
22-10-22°C (1,5°C/cm)	~5,0°C /~25,0°C	~7,5°C/~24,0°C
26-18-26°C (1°C/cm)	~15,8°C /~30,6°C	~16,9°C/~28,4°C
30-14-30°C (2°C/cm)	~8,5°C /~36,4°C	~10,9°C/~32,8°C
36-12,5-36°C (2,95°C/cm)	~5,0°C /~47,2°C	~7,9°C/~40,9°C

Tabella 2: Gradienti di temperatura tipici e temperature corrispondenti dei bagni d'acqua e dei blocchi di alluminio per gradienti bidirezionali.

Età larvale (AEL)	Tempo di dosaggio (direzionale singolo)	Tempo di dosaggio (bidirezionale)
24 ore su 24	30 min	35 min
48 ore	22 min	27 min
72 ore	16 min	21 min
96 ore	13 min	18 min
120 ore	10 min	15 min

Tabella 3: Diverse età larvali (AEL) e i corrispondenti tempi di dosaggio.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124