온도 그라데이션 분석: 드로소필라 애벌레의 온도 선호도를 테스트하는 방법

Overview

드로소필라 과일 파리는 온도의 작은 변화를 구별할 수 있으므로 열 조건이 좋은 환경을 선택할 수 있습니다. 이 비디오는 선형 열 그라데이션에서 Drosophila 애벌레의 온도 선호도를 테스트하는 행동 분석서를 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜은 Liu 외에서 발췌한 것입니다. 드로소필라 애벌레, J. Vis. Exp. (2018)의 열 환경 설정을 결정하는 온도 그라데이션 분석.

1. 온도 그라데이션 설정

1. 단일 방향 그라데이션 준비
   1. 애사 중에 습한 주변 환경을 조성하기 위해 젖은 종이 타월에 두 개의 수조에 연결된 두 개의 알루미늄 블록을 10cm(그림1A)로분리합니다.
   2. 알루미늄 블록의 온도가 평형화될 수 있도록 분석서를 개시하기 전에 두 개의 수조 ~2h를 켭니다.
      참고: 원하는 선형 온도 그라데이션을 달성하는 데 필요한 각 수조의 온도를 결정하기 위해 모의 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 수조를 설정하는 몇 가지 일반적인 온도 쌍은 표 1에나열됩니다. 그러나 표면 온도는 주변 온도의 영향을 받습니다. 튜브의 길이는 또한 튜브에 냉각이 있기 때문에 온도에 영향을 미칩니다. 우리의 설정에서 튜브의 길이는 1.5 m입니다.
   3. 전자레인지 100mL의 1% 아가로즈는 500mL 라운드 와이드 마우스 병에 고출력 세팅을 하고, 레벨 벤치탑에 25mL/분석 판을 붓습니다. 동시에 알루미늄 블록에 배치 할 수있는 두 개의 분석 플레이트를 준비(그림 1A).
   4. 아가로즈가 고화된 후(10-20분), 아가로즈 표면을 약간 거칠게 만들기 위해 표준 주방 스폰지 또는 멜라민 스폰지로 각 아가로즈 표면을 부드럽게 문지르므로 아가로즈 젤에 물을 뿌리면 매끄러운 얇은 물막이 만들어지고 물방울이 형성되지 않습니다.
   5. 분석이 수행 될 준비가 될 때까지 완전히 증류수와 용기에 접시를 침수 플레이트건조되는 것을 방지하기 위해 수행 할 수 있습니다.
2. 양방향 그라데이션 준비(선택 사항)
   1. 애사 중에 습한 주변 환경을 조성하려면 3개의 알루미늄 블록을 8cm 간격으로 배치합니다(그림1B)를젖은 종이 타월에 놓습니다.
   2. 알루미늄 블록의 온도가 평형화될 수 있도록 분석서를 개시하기 전에 두 개의 수조 ~2h를 켭니다.
      참고: 양방향 그라데이션에 대한 각 수조의 온도를 결정하기 위해 모의 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 수조를 설정하는 몇 가지 일반적인 온도 쌍은 표 2에나열됩니다. 그러나 표면 온도는 주변 온도의 영향을 받습니다. 튜브의 길이는 또한 튜브에 냉각이 있기 때문에 온도에 영향을 미칩니다. 우리의 설정에서 튜브의 길이는 1.5 m입니다.
   3. 아가로즈가 접시밖으로 흘러나오는 것을 방지하기 위해 알루미늄 판의 가장자리를 라벨 테이프로 감싸 10mm 높이의벽(도 1B)을형성합니다.
   4. 고출력 세팅을 사용하여 500mL 라운드 와이드 마우스 병에 1% 아가로즈의 200mL를 전자레인지에 넣고 분석 접시에 120mL를 붓습니다.
   5. 아가로즈가 고화된 후(~30분), 아가로즈 표면을 약간 거칠게 만들기 위해 표준 주방 스폰지 나 멜라민 스폰지로 각 아가로즈 표면을 부드럽게 문지르므로 아가로즈 젤에 물을 뿌리면 매끄러운 얇은 물막이 만들어지고 물방울이 형성되지 않습니다.
   6. 분석이 건조되지 않도록 하기 위해 수행 될 준비가 될 때까지 증류수와 용기에 분석 플레이트를 완전히 잠급.
3. 단일 방향 그라데이션 설정
   1. 그라데이션 분석 장치 옆에 있는 벤치에서 시약 및 항목을 준비합니다(재료 표참조).
   2. 효율적인 온도 전달을 촉진하기 위해 블록과 플레이트 사이의 인터페이스에 물을 분사하여 알루미늄 블록과 분석 플레이트 사이의 간격을 채웁니다.
   3. 장갑을 사용하여 물 용기에서 분석 판을 제거합니다. 물이 아가로즈 젤과 플레이트 사이에 침입하여 표면에 범프가 형성되는 경우 P1000 마이크로 파이프로 물을 제거하십시오.
   4. 알루미늄 블록에 분석 플레이트를 배치하여 양쪽 가장자리에서 2cm 인 경계가 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치되도록합니다(그림 1A, C).
   5. 아가로즈 젤이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시 표면에 물을 분무하십시오 (아가로즈 표면을 덮는 얇은 물 막이 충분합니다). 유충이 물방울에 갇힐 수 있기 때문에 물방울이 연속적이고 무료인지 확인하십시오.
   6. 물 증발을 줄이고 젤 표면의 온도를 안정화하는 데 도움이 골판지 상자로 그라데이션 시스템을 덮습니다. 온도가 평형화 될 수 있도록 5-10 분 기다립니다.
   7. 플레이트의 12점에서 표면 온도를 확인합니다(그림1C). 각 영역 내에서 두 번측정하여 영역 내에 가변성이 있는지 여부를 설정합니다. 두 반점의 온도가 원하는 온도의 ± 0.2°C 이내인지 확인하십시오.
      참고: 알루미늄 블록의 가장자리에 두 반점의 정확한 거리가 동일하지 않기 때문에 영역 내의 가변성은 일반적으로 발생합니다. 알루미늄 블록의 플레이트 위치를 조정하여 양쪽 가장자리에서 2cm인 경계가 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하는지 확인합니다.
   8. 측정된 온도 그라데이션이 원하는 그라데이션에서 벗어나면 수조 온도 설정이 증가 또는 감소하며 수조의 온도가 안정화된 후 표면 온도를 다시 확인합니다.
   9. 분석이 시작될 때까지 골판지 상자로 그라데이션 시스템을 덮습니다.
4. 양방향 그라데이션 설정(선택 사항)
   1. 그라데이션 분석 장치 옆에 있는 벤치에서 시약 및 항목을 준비합니다(재료 표참조).
   2. 세 개의 알루미늄 블록 표면에 물을 분무하여 표면 사이의 간격을 채우면 알루미늄 블록에서 분석 플레이트로의 효율적인 온도 전달을 촉진합니다.
   3. 물 용기에서 조심스럽게 분석 판을 제거하고 알루미늄 블록에 배치합니다. 물이 아가로즈 젤과 플레이트 사이에 침입하면 표면에 충돌이 형성될 수 있으며 P1000 마이크로 파이프로 물을 제거하십시오.
   4. 알루미늄 블록에 분석 판을 배치하여 양쪽 가장자리에서 첫 번째 및 마지막 영역의 중간선이 두 면 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치되도록합니다(그림 1B,D).
   5. 아가로즈 젤이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시 표면에 물을 분무하십시오 (아가로즈 표면을 덮는 얇은 물 막이 충분합니다). 유충이 물방울에 갇힐 수 있기 때문에 수막이 연속적이고 물방울이 없는지 확인하십시오.
   6. 물 증발을 줄이고 젤 표면의 온도를 안정화하는 데 도움이 골판지 상자로 그라데이션 시스템을 덮습니다. 온도를 평형할 수 있도록 5-10분 기다립니다.
   7. 10개영역(도1D)의중간선을 따라 2점에서 표면 온도를 확인합니다. 각 영역 내에서 두 번측정하여 영역 내에 가변성이 있는지 여부를 설정합니다. 두 반점의 온도가 원하는 온도의 ± 0.2°C 이내인지 확인하십시오.
      참고: 알루미늄 블록의 가장자리에 두 반점의 정확한 거리가 동일하지 않기 때문에 영역 내의 가변성은 일반적으로 발생합니다. 알루미늄 블록의 플레이트 위치를 조정하여 두 면 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하는 첫 번째 및 마지막 영역의 중간선이 있는지 확인합니다.
   8. 측정된 온도 그라데이션이 원하는 그라데이션에서 벗어나면 수조 온도 설정을 조정하고 수조의 온도가 안정화된 후 표면 온도를 다시 확인합니다.
   9. 분석이 시작될 때까지 골판지 상자로 블록을 덮습니다.

2. 분석 및 계산

1. 골판지 상자를 제거하고 애벌레를 접시에 옮기기 직전에 젤 표면 온도를 확인하십시오. 온도 평형을 방해하지 않도록 골판지 상자가 열려 있는 시간을 최소화합니다. 표면이 건조하면 표면에 소량의 물을 뿌립니다.
2. 단일 방향 그라데이션(release zone; ± 그림 1C).
   참고: 양방향 그라데이션의 경우, 각 절반의 중간 영역을 따라 200-400 애벌레를 분배한다(도1D).
3. 각 분석 접시 위에 마이크로 플레이트 뚜껑을 두어 유충이 기어 나가는 것을 방지합니다. 아가로즈 젤의 애벌레 선택에 영향을 줄 수 있는 가벼운 노출을 방지하기 위해 골판지 상자로 설정을 덮습니다.
   참고: 양방향 그라데이션의 경우 플레이트가 더 크고 애벌레의 바람직한 온도가 중간 영역에 있기 때문에 뚜껑으로 플레이트를 덮을 필요가 없습니다. 따라서 가장자리에 축적된 애벌레는 거의 없으며 크롤링할 기회가 있습니다.
4. 편도그라데이션에 대해 10-30분, 유충의 나이에 따라 양방향 그라데이션에 대해 15-35분 동안 분석이 진행되도록한다(표 3).
5. 골판지 상자와 마이크로 플레이트 뚜껑을 제거합니다. 디지털 카메라를 사용하여 위의 플레이트를 촬영합니다. 각 분석 판의 두 장의 사진을 찍어 조사관이 분석을 위해 더 나은 대비와 밝기를 가진 사진을 선택할 수 있습니다.
6. 애벌레를 모두 분석 접시에서 제거하고 흡인으로 접시 밖의 모든 것을 제거하십시오.
7. 분석 플레이트, 튜브 및 셀 스트레이너를 증류수로 철저히 청소하십시오. 아가로즈 표면이 손상되지 않는 한 그날 준비된 분석 판을 재사용하십시오.
8. 각 영역에서 유충의 백분율 분포를 계산합니다.
   1. 이미지에 표시를 추가할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 분석 결과의 사진 이미지를 엽니다. 분석 영역을 나타내려면 분석 판의 경계에 따라 2cm마다 수직 선을 그립니다.
   2. 각 영역의 애벌레 수를 계산하고 숫자를 기록합니다. 벽에서 0.5cm 떨어진 지역에서는 애벌레를 세지 마십시오. 젤은 벽 근처에서 두껍고 표면 온도는 이러한 영역에서 선형이 아닙니다.
   3. 단일 방향 그라데이션의 경우 각 영역의 백분율 분포를 다음과 같이 계산합니다.
      (주어진 2cm 영역에서 유충의 수)/ /(6 구역에서 유충의 총 수) x 100.
   4. 양방향 그라데이션의 경우 각 영역의 백분율 분포를 다음과 같이 계산합니다.
      (주어진 2cm 영역에서 유충의 수)/ (그라데이션의 각 측면에 5 영역에서 유충의 총 수) x 100.

Representative Results

그림 1: 단일 및 양방향 그라데이션 분석 설정입니다. (A) 두 개의 알루미늄 블록에 두 개의 알루미늄 분석 플레이트가 있는 단일 방향 그라데이션 설정. 알루미늄 블록의 온도는 두 개의 수조에서 물을 순환하여 제어됩니다. (B) 양방향 그라데이션을 위한 3개의 알루미늄 블록, 수조 및 알루미늄 플레이트(250 x 220mm)의 배열. 왼쪽과 오른쪽 블록은 동일한 수조에 연결되어 있으며 중간 블록은 다른 수조에 연결되어 있습니다. 알루미늄 분석 플레이트는 테이프로 감싸서 1% 아가로즈를 함유하는 10mm 벽을 형성합니다. (C) 온도(점으로 표시)를 확인하고 접시에 애벌레를 방출하는 위치. 실험을 시작하기 전에 각 영역 내의 두 지점에서 온도를 확인하여 원하는 선형 온도 그라데이션이 확립되어 있는지 확인합니다. 유충은 중간선 근처의 표시된 영역 내에서 방출됩니다. 유충은 각 2cm 구역 내에 계산됩니다. (D) 양방향 그라데이션에서 유충의 온도(점으로 표시)와 방출 영역을 확인하는 위치입니다. 양방향 그라데이션의 각 절반의 중간선을 따라 동일한 수의 애벌레가 방출됩니다. 애벌레의 수는 각각 10 (2cm) 영역에서 계산됩니다. 아가로즈 표면의 한 가지 전형적인 온도 세트(18°C-26°C)가 표시된다. (E) 샘플 단일 방향 그라데이션에서 각 영역의 경계선과 중간선을 따라 측정된 온도입니다. 데이터는 SD. n = 8 분석 (150 ± 50 애벌레 / 분석)± 평균 온도를 나타냅니다. 이 그림의 일부는 소카베 등에서 약간의 수정으로 재현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

아가로즈 플레이트의 온도 그라데이션(경사)	수조의 온도	알루미늄 블록의 온도
10.0-25.0°C (1.5°C/cm)	~6.5-7°C/~28.5°C	~8.5°C/~26.8°C
18.0-28.0°C(1°C/cm)	~16.8°C/~31.0°C	~17.8°C/~29.7°C
14.0-34.0°C (2°C/cm)	~10.0°C/~40.0°C	~11.8°C/~36.8°C
12.5-42.0°C (2.95°C/cm)	~7.0°C/~55.0°C	~9.4°C/~49.4°C

표 1: 일반적인 온도 그라데이션과 단일 방향 그라데이션을 위한 수조 및 알루미늄 블록의 해당 온도.

아가로즈 플레이트의 온도 그라데이션	수조의 온도	알루미늄 블록의 온도
22-10-22°C (1.5°C/cm)	~5.0°C /~25.0°C	~7.5°C/~24.0°C
26-18-26°C (1°C/cm)	~15.8°C /~30.6°C	~16.9°C/~28.4°C
30-14-30°C (2°C/cm)	~8.5°C /~36.4°C	~10.9°C/~32.8°C
36-12.5-36°C (2.95°C/cm)	~5.0°C /~47.2°C	~7.9°C/~40.9°C

표 2: 일반적인 온도 그라데이션과 양방향 그라데이션을 위한 수조 및 알루미늄 블록의 해당 온도.

라발 나이 (AEL)	분석 시간(단일 방향)	분석 시간(양방향)
24 h	30분	약 35분
48 h	22분	27분
72 h	16분	21분
96 h	약 13분	약 18분
120 h	10분	약 15분

표 3: 다른 애벌레 나이 (AEL) 및 해당 분석 시간.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124