Overview
드로소필라 과일 파리는 온도의 작은 변화를 구별할 수 있으므로 열 조건이 좋은 환경을 선택할 수 있습니다. 이 비디오는 선형 열 그라데이션에서 Drosophila 애벌레의 온도 선호도를 테스트하는 행동 분석서를 설명합니다.
Protocol
이 프로토콜은 Liu 외에서 발췌한 것입니다. 드로소필라 애벌레, J. Vis. Exp. (2018)의 열 환경 설정을 결정하는 온도 그라데이션 분석.
1. 온도 그라데이션 설정
- 단일 방향 그라데이션 준비
- 애사 중에 습한 주변 환경을 조성하기 위해 젖은 종이 타월에 두 개의 수조에 연결된 두 개의 알루미늄 블록을 10cm(그림1A)로분리합니다.
- 알루미늄 블록의 온도가 평형화될 수 있도록 분석서를 개시하기 전에 두 개의 수조 ~2h를 켭니다.
참고: 원하는 선형 온도 그라데이션을 달성하는 데 필요한 각 수조의 온도를 결정하기 위해 모의 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 수조를 설정하는 몇 가지 일반적인 온도 쌍은 표 1에나열됩니다. 그러나 표면 온도는 주변 온도의 영향을 받습니다. 튜브의 길이는 또한 튜브에 냉각이 있기 때문에 온도에 영향을 미칩니다. 우리의 설정에서 튜브의 길이는 1.5 m입니다. - 전자레인지 100mL의 1% 아가로즈는 500mL 라운드 와이드 마우스 병에 고출력 세팅을 하고, 레벨 벤치탑에 25mL/분석 판을 붓습니다. 동시에 알루미늄 블록에 배치 할 수있는 두 개의 분석 플레이트를 준비(그림 1A).
- 아가로즈가 고화된 후(10-20분), 아가로즈 표면을 약간 거칠게 만들기 위해 표준 주방 스폰지 또는 멜라민 스폰지로 각 아가로즈 표면을 부드럽게 문지르므로 아가로즈 젤에 물을 뿌리면 매끄러운 얇은 물막이 만들어지고 물방울이 형성되지 않습니다.
- 분석이 수행 될 준비가 될 때까지 완전히 증류수와 용기에 접시를 침수 플레이트건조되는 것을 방지하기 위해 수행 할 수 있습니다.
- 양방향 그라데이션 준비(선택 사항)
- 애사 중에 습한 주변 환경을 조성하려면 3개의 알루미늄 블록을 8cm 간격으로 배치합니다(그림1B)를젖은 종이 타월에 놓습니다.
- 알루미늄 블록의 온도가 평형화될 수 있도록 분석서를 개시하기 전에 두 개의 수조 ~2h를 켭니다.
참고: 양방향 그라데이션에 대한 각 수조의 온도를 결정하기 위해 모의 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 수조를 설정하는 몇 가지 일반적인 온도 쌍은 표 2에나열됩니다. 그러나 표면 온도는 주변 온도의 영향을 받습니다. 튜브의 길이는 또한 튜브에 냉각이 있기 때문에 온도에 영향을 미칩니다. 우리의 설정에서 튜브의 길이는 1.5 m입니다. - 아가로즈가 접시밖으로 흘러나오는 것을 방지하기 위해 알루미늄 판의 가장자리를 라벨 테이프로 감싸 10mm 높이의벽(도 1B)을형성합니다.
- 고출력 세팅을 사용하여 500mL 라운드 와이드 마우스 병에 1% 아가로즈의 200mL를 전자레인지에 넣고 분석 접시에 120mL를 붓습니다.
- 아가로즈가 고화된 후(~30분), 아가로즈 표면을 약간 거칠게 만들기 위해 표준 주방 스폰지 나 멜라민 스폰지로 각 아가로즈 표면을 부드럽게 문지르므로 아가로즈 젤에 물을 뿌리면 매끄러운 얇은 물막이 만들어지고 물방울이 형성되지 않습니다.
- 분석이 건조되지 않도록 하기 위해 수행 될 준비가 될 때까지 증류수와 용기에 분석 플레이트를 완전히 잠급.
- 단일 방향 그라데이션 설정
- 그라데이션 분석 장치 옆에 있는 벤치에서 시약 및 항목을 준비합니다(재료 표참조).
- 효율적인 온도 전달을 촉진하기 위해 블록과 플레이트 사이의 인터페이스에 물을 분사하여 알루미늄 블록과 분석 플레이트 사이의 간격을 채웁니다.
- 장갑을 사용하여 물 용기에서 분석 판을 제거합니다. 물이 아가로즈 젤과 플레이트 사이에 침입하여 표면에 범프가 형성되는 경우 P1000 마이크로 파이프로 물을 제거하십시오.
- 알루미늄 블록에 분석 플레이트를 배치하여 양쪽 가장자리에서 2cm 인 경계가 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치되도록합니다(그림 1A, C).
- 아가로즈 젤이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시 표면에 물을 분무하십시오 (아가로즈 표면을 덮는 얇은 물 막이 충분합니다). 유충이 물방울에 갇힐 수 있기 때문에 물방울이 연속적이고 무료인지 확인하십시오.
- 물 증발을 줄이고 젤 표면의 온도를 안정화하는 데 도움이 골판지 상자로 그라데이션 시스템을 덮습니다. 온도가 평형화 될 수 있도록 5-10 분 기다립니다.
- 플레이트의 12점에서 표면 온도를 확인합니다(그림1C). 각 영역 내에서 두 번측정하여 영역 내에 가변성이 있는지 여부를 설정합니다. 두 반점의 온도가 원하는 온도의 ± 0.2°C 이내인지 확인하십시오.
참고: 알루미늄 블록의 가장자리에 두 반점의 정확한 거리가 동일하지 않기 때문에 영역 내의 가변성은 일반적으로 발생합니다. 알루미늄 블록의 플레이트 위치를 조정하여 양쪽 가장자리에서 2cm인 경계가 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하는지 확인합니다. - 측정된 온도 그라데이션이 원하는 그라데이션에서 벗어나면 수조 온도 설정이 증가 또는 감소하며 수조의 온도가 안정화된 후 표면 온도를 다시 확인합니다.
- 분석이 시작될 때까지 골판지 상자로 그라데이션 시스템을 덮습니다.
- 양방향 그라데이션 설정(선택 사항)
- 그라데이션 분석 장치 옆에 있는 벤치에서 시약 및 항목을 준비합니다(재료 표참조).
- 세 개의 알루미늄 블록 표면에 물을 분무하여 표면 사이의 간격을 채우면 알루미늄 블록에서 분석 플레이트로의 효율적인 온도 전달을 촉진합니다.
- 물 용기에서 조심스럽게 분석 판을 제거하고 알루미늄 블록에 배치합니다. 물이 아가로즈 젤과 플레이트 사이에 침입하면 표면에 충돌이 형성될 수 있으며 P1000 마이크로 파이프로 물을 제거하십시오.
- 알루미늄 블록에 분석 판을 배치하여 양쪽 가장자리에서 첫 번째 및 마지막 영역의 중간선이 두 면 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치되도록합니다(그림 1B,D).
- 아가로즈 젤이 건조되는 것을 방지하기 위해 접시 표면에 물을 분무하십시오 (아가로즈 표면을 덮는 얇은 물 막이 충분합니다). 유충이 물방울에 갇힐 수 있기 때문에 수막이 연속적이고 물방울이 없는지 확인하십시오.
- 물 증발을 줄이고 젤 표면의 온도를 안정화하는 데 도움이 골판지 상자로 그라데이션 시스템을 덮습니다. 온도를 평형할 수 있도록 5-10분 기다립니다.
- 10개영역(도1D)의중간선을 따라 2점에서 표면 온도를 확인합니다. 각 영역 내에서 두 번측정하여 영역 내에 가변성이 있는지 여부를 설정합니다. 두 반점의 온도가 원하는 온도의 ± 0.2°C 이내인지 확인하십시오.
참고: 알루미늄 블록의 가장자리에 두 반점의 정확한 거리가 동일하지 않기 때문에 영역 내의 가변성은 일반적으로 발생합니다. 알루미늄 블록의 플레이트 위치를 조정하여 두 면 알루미늄 블록의 가장자리와 정확히 일치하는 첫 번째 및 마지막 영역의 중간선이 있는지 확인합니다. - 측정된 온도 그라데이션이 원하는 그라데이션에서 벗어나면 수조 온도 설정을 조정하고 수조의 온도가 안정화된 후 표면 온도를 다시 확인합니다.
- 분석이 시작될 때까지 골판지 상자로 블록을 덮습니다.
2. 분석 및 계산
- 골판지 상자를 제거하고 애벌레를 접시에 옮기기 직전에 젤 표면 온도를 확인하십시오. 온도 평형을 방해하지 않도록 골판지 상자가 열려 있는 시간을 최소화합니다. 표면이 건조하면 표면에 소량의 물을 뿌립니다.
- 단일 방향 그라데이션(release zone; ± 그림 1C).
참고: 양방향 그라데이션의 경우, 각 절반의 중간 영역을 따라 200-400 애벌레를 분배한다(도1D). - 각 분석 접시 위에 마이크로 플레이트 뚜껑을 두어 유충이 기어 나가는 것을 방지합니다. 아가로즈 젤의 애벌레 선택에 영향을 줄 수 있는 가벼운 노출을 방지하기 위해 골판지 상자로 설정을 덮습니다.
참고: 양방향 그라데이션의 경우 플레이트가 더 크고 애벌레의 바람직한 온도가 중간 영역에 있기 때문에 뚜껑으로 플레이트를 덮을 필요가 없습니다. 따라서 가장자리에 축적된 애벌레는 거의 없으며 크롤링할 기회가 있습니다. - 편도그라데이션에 대해 10-30분, 유충의 나이에 따라 양방향 그라데이션에 대해 15-35분 동안 분석이 진행되도록한다(표 3).
- 골판지 상자와 마이크로 플레이트 뚜껑을 제거합니다. 디지털 카메라를 사용하여 위의 플레이트를 촬영합니다. 각 분석 판의 두 장의 사진을 찍어 조사관이 분석을 위해 더 나은 대비와 밝기를 가진 사진을 선택할 수 있습니다.
- 애벌레를 모두 분석 접시에서 제거하고 흡인으로 접시 밖의 모든 것을 제거하십시오.
- 분석 플레이트, 튜브 및 셀 스트레이너를 증류수로 철저히 청소하십시오. 아가로즈 표면이 손상되지 않는 한 그날 준비된 분석 판을 재사용하십시오.
- 각 영역에서 유충의 백분율 분포를 계산합니다.
- 이미지에 표시를 추가할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 분석 결과의 사진 이미지를 엽니다. 분석 영역을 나타내려면 분석 판의 경계에 따라 2cm마다 수직 선을 그립니다.
- 각 영역의 애벌레 수를 계산하고 숫자를 기록합니다. 벽에서 0.5cm 떨어진 지역에서는 애벌레를 세지 마십시오. 젤은 벽 근처에서 두껍고 표면 온도는 이러한 영역에서 선형이 아닙니다.
- 단일 방향 그라데이션의 경우 각 영역의 백분율 분포를 다음과 같이 계산합니다.
(주어진 2cm 영역에서 유충의 수)/ /(6 구역에서 유충의 총 수) x 100. - 양방향 그라데이션의 경우 각 영역의 백분율 분포를 다음과 같이 계산합니다.
(주어진 2cm 영역에서 유충의 수)/ (그라데이션의 각 측면에 5 영역에서 유충의 총 수) x 100.
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Representative Results
그림 1: 단일 및 양방향 그라데이션 분석 설정입니다. (A) 두 개의 알루미늄 블록에 두 개의 알루미늄 분석 플레이트가 있는 단일 방향 그라데이션 설정. 알루미늄 블록의 온도는 두 개의 수조에서 물을 순환하여 제어됩니다. (B) 양방향 그라데이션을 위한 3개의 알루미늄 블록, 수조 및 알루미늄 플레이트(250 x 220mm)의 배열. 왼쪽과 오른쪽 블록은 동일한 수조에 연결되어 있으며 중간 블록은 다른 수조에 연결되어 있습니다. 알루미늄 분석 플레이트는 테이프로 감싸서 1% 아가로즈를 함유하는 10mm 벽을 형성합니다. (C) 온도(점으로 표시)를 확인하고 접시에 애벌레를 방출하는 위치. 실험을 시작하기 전에 각 영역 내의 두 지점에서 온도를 확인하여 원하는 선형 온도 그라데이션이 확립되어 있는지 확인합니다. 유충은 중간선 근처의 표시된 영역 내에서 방출됩니다. 유충은 각 2cm 구역 내에 계산됩니다. (D) 양방향 그라데이션에서 유충의 온도(점으로 표시)와 방출 영역을 확인하는 위치입니다. 양방향 그라데이션의 각 절반의 중간선을 따라 동일한 수의 애벌레가 방출됩니다. 애벌레의 수는 각각 10 (2cm) 영역에서 계산됩니다. 아가로즈 표면의 한 가지 전형적인 온도 세트(18°C-26°C)가 표시된다. (E) 샘플 단일 방향 그라데이션에서 각 영역의 경계선과 중간선을 따라 측정된 온도입니다. 데이터는 SD. n = 8 분석 (150 ± 50 애벌레 / 분석)± 평균 온도를 나타냅니다. 이 그림의 일부는 소카베 등에서 약간의 수정으로 재현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
아가로즈 플레이트의 온도 그라데이션(경사) | 수조의 온도 | 알루미늄 블록의 온도 |
10.0-25.0°C (1.5°C/cm) | ~6.5-7°C/~28.5°C | ~8.5°C/~26.8°C |
18.0-28.0°C(1°C/cm) | ~16.8°C/~31.0°C | ~17.8°C/~29.7°C |
14.0-34.0°C (2°C/cm) | ~10.0°C/~40.0°C | ~11.8°C/~36.8°C |
12.5-42.0°C (2.95°C/cm) | ~7.0°C/~55.0°C | ~9.4°C/~49.4°C |
표 1: 일반적인 온도 그라데이션과 단일 방향 그라데이션을 위한 수조 및 알루미늄 블록의 해당 온도.
아가로즈 플레이트의 온도 그라데이션 | 수조의 온도 | 알루미늄 블록의 온도 |
22-10-22°C (1.5°C/cm) | ~5.0°C /~25.0°C | ~7.5°C/~24.0°C |
26-18-26°C (1°C/cm) | ~15.8°C /~30.6°C | ~16.9°C/~28.4°C |
30-14-30°C (2°C/cm) | ~8.5°C /~36.4°C | ~10.9°C/~32.8°C |
36-12.5-36°C (2.95°C/cm) | ~5.0°C /~47.2°C | ~7.9°C/~40.9°C |
표 2: 일반적인 온도 그라데이션과 양방향 그라데이션을 위한 수조 및 알루미늄 블록의 해당 온도.
라발 나이 (AEL) | 분석 시간(단일 방향) | 분석 시간(양방향) |
24 h | 30분 | 약 35분 |
48 h | 22분 | 27분 |
72 h | 16분 | 21분 |
96 h | 약 13분 | 약 18분 |
120 h | 10분 | 약 15분 |
표 3: 다른 애벌레 나이 (AEL) 및 해당 분석 시간.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gradient assay apparatus | |||
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Items and reagents for assay | |||
Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
Thermometer | Fluke | 51II | |
Thermocouple | Fluke | K type | |
Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 |