德罗索菲拉 活动监视器（DAM）：测量苍蝇运动活动的方法

Overview

此视频描述了用于跟踪运动活动的 嗜血杆菌 活动监视器 （DAM） 系统。研究人员利用从DAM收集的活动数据来研究果蝇的昼夜节律。特色协议剪辑显示如何在设备中加载苍蝇，并记录昼夜实验的活动数据。

Protocol

本协议摘自Chiu等人的《阿萨英运动活动》，以研究J.Vis.Exp.德罗索菲拉的昼夜节律和睡眠参数（2010年）。 

1. 将苍蝇装载到活动管和运动活动监测系统中

1. 在将苍蝇加载到活动管中之前，打开用于存放活动监视器的孵化器。使用孵化器控制调节温度，并使用 DAM 系统光控制器或孵化器根据所需的实验设计自行设置光/暗系统。将苍蝇装载到活动管中所需的时间应足以稳定温度。
2. 用二氧化碳麻醉苍蝇。
3. 使用精细的画笔将一只苍蝇轻轻地转移到活动管中。
4. 抓住一块约半英寸的细钳子的纱线中间，将纱线插入活动管的非食物端，以插入开口，防止苍蝇在实验期间逃跑，同时允许气流进入管内。或者，小孔塑料帽（三动力学公司）可用于关闭开口。
5. 确保管子放在它们的两侧，直到苍蝇醒来，否则有苍蝇粘在食物上的风险。
6. 将管子插入活动监视器。使用更新、更紧凑的三动力学监视器模型（三动力学 DAM2 和 DAM2-7），有必要用橡皮筋将管子保持到位，以确保红外光束通过中心位置的管子。
7. 将活动监视器放入孵化器中，并通过电话线将其连接到数据收集系统。使用 DAM 系统收集软件进行检查，以确保所有监视器都正确连接，并且从每个监视器中收集数据。监视器在每个玻璃活动管的中心发射红外光束。苍蝇的运动活动记录为原始二进制数据，每次红外光束断裂或红外光束未断开时记录"一个"。

2. 用于记录昼夜周期和振幅数据的实验设计

1. 苍蝇通过将它们暴露在所需的光/暗（LD）和温度系统中整整2-5天来同步和训练。最常用的诱因条件是在 25 °C 处的 12 小时光/12 小时深（12：12 LD）的光/暗周期。 这一普遍接受的标准条件基本上是基于德 罗索菲拉 起源于非洲赤道地区的想法。在研究昼夜节律时，有一些短语需要人们熟悉。与此协议相关，孵化器中灯亮的时间定义为时代格伯时间 0 （ZT0），所有其他时间均与该值相关（例如，在 12：12 LD 周期中，ZT12 是关闭灯的时间）。在标准 12：12 LD 条件下，野生型 德罗索菲拉梅拉诺加斯特 通常表现出两轮活动：一个围绕ZT0称为"早晨"高峰，另一个围绕ZT12被称为"晚上"高峰（图1A）。早晚回合由内生时钟控制，但也有"惊吓"的反应，是短暂的活动爆发，以响应光/暗过渡。两天的禁忌是最低限度的，可以用于大屏幕，例如，在大屏幕中，这些屏幕更耗时，并且旨在测量恒定的黑暗中的自由运行周期（见下文，第 2 步）。但是，如果您有兴趣研究每日光暗周期的活动模式，最好在 LD 中将苍蝇保持 4-5 天，以便获得更多数据。从本质上讲，增加最终数据分析中的苍蝇数量或LD天数（例如，LD运动活动最后两天的汇集数据）将产生更可靠的日间活动剖面和测量（例如，早高峰或晚高峰的时间）。此外，活动的每日分布因日长（光周）和温度的函数而异。改变光周或温度从标准的一个主要原因是，如果一个人想研究如何日常活动模式进行季节性适应（如陈等人，冷泉哈布Symb Quant Biol。 （2007）。 德罗索菲拉 也可以适应每日温度周期（如格拉泽和斯塔内夫斯基， 库尔·比奥尔）。 (2005);塞哈多娃等人， 神经元 （2009年）。温度周期仅变化 2-3 °C，足以约束活动节奏。
2. 自由奔跑运动运动节奏在固定的黑暗和温度条件下测量后，诱捕期完成（见上文，第1步）。在LD的最后一天的黑暗阶段，光周期的设置可以随时改变，因此实验的后续日代表DD的第一天。 DD数据收集的七天足以计算苍蝇的昼夜周期和振幅（例如，节奏的力量或强度）。一般来说，为了获得特定基因型的可靠自由运行周期，至少需要 16 只苍蝇的样本大小。即使人们只对测量日活动感兴趣，最好还是测量苍蝇在DD中的自由运行周期，因为内源期的变化可以改变LD活动的日常分布。例如，内源期较长的苍蝇通常在 LD 中表现出延迟的夜间高峰（例如，见 图 2）。
3. 实验结束时，使用 DAM 系统软件收集的原始二进制数据被下载到便携式数据存储设备上，例如 USB 密钥。
4. 原始二进制数据使用 DAM Filescan102X（三动力学公司）进行处理，并在分析昼夜参数时将汇总为 15 分钟和 30 分钟的 bin，或在分析睡眠/休息参数时将 1 到 5 分钟的 bins。目前，连续五分钟的不活动是 德罗索菲拉 睡眠/休息的标准定义（亨德里克斯等人，神经元 （2000年）：何和塞加尔， 方法酶醇 ，（2005年）。
5. 有许多不同的方法来分析在DAM系统上收集的数据，但我们只会提供这些方法在我们的实验室中经常使用。微软 Excel 用于向不同的样本组分配基因型。FaasX软件（M.布迪诺特和F.鲁耶，国家科学研究中心，吉夫-苏尔-伊维特·塞代克斯，法国）或失眠症（基于马特拉布的项目;宾夕法尼亚州匹兹堡大学的莱斯利·阿什莫尔（Leslie Ashmore）分别用于检查昼夜（如周期和能量）或睡眠/休息（如睡眠百分比、平均休息时间）参数。

Representative Results

图1：使用FaasX生成的感应图显示有节奏的野生类型苍蝇的每日运动活动节奏（ 每⁰ 只苍蝇携带1个转基因苍蝇）（A和B）与 每⁰ 个突变体（C和D）的心律失常。 雄性苍蝇被保持在25°C，并在12：12 LD（光：暗）周期内训练4天，然后在DD（持续黑暗）中训练7天。对于每条飞行线，单个苍蝇（n>32）的运动活动水平在15分钟的垃圾箱中测量，然后平均获得该线的组配置文件代表。A 和 C 显示在光/暗周期 （LD 2-3） 中平均第二天和第三天产生的活动数据，而 B 和 D 显示在持续黑暗中平均第二天和第三天生成的活动数据 （DD 2-3）。垂直条表示在光时期（浅灰色）或暗期（深灰色）期间记录在 15 分钟垃圾箱中的活动（任意单位）。LD 教育图底部的水平条;白色，灯亮着;黑色， 熄灯。ZT0 和 ZT12 分别表示照片的开始和结束。对于 DD 感应图;CT0 和 CT12 表示在恒定的黑暗条件下主观一天的开始和结束，由灰色条表示。在面板A中，M=早高峰：E=晚间高峰。面板 A 中的箭头表示在野生类型苍蝇中观察到的早晚高峰的预期行为，这些行为 在 w 每⁰ 只心律失常苍蝇中不存在。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：使用FaasX软件生成的双图活动图，说明野生类型、短周期或长周期苍蝇的运动活动数据。 雄性苍蝇保持在 25 °C，在 12：12 LD 周期中训练 4 天，然后在恒定的黑暗 （DD） 中训练 8 天，用于计算在 FaasX 中使用 Cycle-P 计算自由运行期 （t） 。三条具有野生类型周期的飞行线 [w 每⁰; 每+; 每⁰ 突变携带每+ 转基因]， 长期 [w 每^0;每 （S47A）： 每⁰ 突变携带每 （S47A） 转基因， 和短周期 [w 每^0：每 （S47D）： 每⁰ 突变携带每 （S47D） 转基因] 显示在这里 （邱 等人 2008）.X 轴分别表示 LD 或 DD 中的 ZT 或 CT 时间，Y 轴表示活动计数（任意单位）归纳为 15 分钟箱。红色的虚线连接着每天实验的夜峰。请注意，在 LD 期间，晚间高峰"被迫"与 24 小时 LD 周期保持同步，而在 DD 中，自由运行周期可能偏离 24 小时。例如，对于周期较短的苍蝇，晚上活动的时间将在DD中连续每一天发生较早的时间（如图所示，在24小时时间尺度上绘制），而对于长时间飞行的苍蝇，则观察到向右移动。 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014