Drosophila ( Drosophila ) Moniteur d’activité (DAM) : Méthode de mesure de l’activité locomotrice chez les mouches

Overview

Cette vidéo décrit le système dam (Drosophila activity monitor) utilisé pour suivre l’activité locomotrice. Les chercheurs utilisent les données d’activité recueillies auprès du DAM pour étudier les rythmes circadiens chez les mouches des fruits. Le clip de protocole en vedette montre comment charger les mouches dans l’appareil et enregistrer les données d’activité pour les expériences circadiennes.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Chiu et coll.,Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp. (2010).

1. Chargement des mouches dans les tubes d’activité et le système de surveillance de l’activité locomotrice

1. Avant de charger les mouches dans des tubes d’activité, allumez les incubateurs qui seront utilisés pour abriter les moniteurs d’activité. Ajustez la température à l’aide des commandes de l’incubateur et réglez le régime lumière/obscurité à l’aide du contrôleur de lumière DAM System OU du système de contrôle de la lumière propre aux incubateurs selon la conception expérimentale souhaitée. Le temps nécessaire pour charger les mouches dans les tubes d’activité devrait être suffisant pour que la température se stabilise.
2. Anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone.
3. Utilisez un pinceau fin pour transférer doucement une seule mouche dans un tube d’activité.
4. Prenez le milieu d’un seul morceau de fil qui est d’environ un demi-pouce avec des forceps fins et insérez le fil dans l’extrémité non alimentaire du tube d’activité pour boucher l’ouverture et empêcher la mouche de s’échapper pendant l’expérience, tout en permettant le flux d’air dans le tube. Alternativement, des bouchons en plastique avec de petits trous (Trikinetics, Inc.) peuvent être utilisés pour fermer l’ouverture.
5. Assurez-vous que les tubes sont posés sur leurs côtés jusqu’à ce que la mouche se réveille, ou bien il ya le risque de la mouche se coincer à la nourriture.
6. Insérez les tubes dans les moniteurs d’activité. Avec le nouveau modèle plus compact des moniteurs Trikinetics (Trikinetics DAM2 et DAM2-7), il est nécessaire de maintenir les tubes en place avec des élastiques pour s’assurer que le faisceau infrarouge passe le tube à la position centrale.
7. Placez les moniteurs d’activité dans les incubateurs et branchez-les au système de collecte de données via les fils téléphoniques. Vérifiez à l’aide du logiciel de collecte dam system pour vous assurer que tous les moniteurs sont branchés correctement et que les données sont collectées auprès de chacun d’eux. Le moniteur émet un faisceau lumineux infrarouge à travers le centre de chaque tube d’activité en verre. L’activité locomotrice des mouches est enregistrée sous forme de données binaires brutes où « une » est enregistrée chaque fois que le faisceau infrarouge est brisé ou qu’un « zéro » est enregistré dans lequel le faisceau infrarouge n’est pas brisé.

2. Conception expérimentale pour enregistrer des données pour la détermination de la périodique circadienne et de l’amplitude

1. Les mouches sont synchronisées et entraînées en les exposant à la lumière/obscurité désirée (LD) et au régime de température pendant 2-5 jours complets. L’état d’entraînement le plus couramment utilisé est un cycle clair/sombre de 12 heures de lumière/ 12 heures d’obscurité (12:12 LD) à 25 °C. Cette condition standard généralement acceptée est essentiellement basée sur la pensée que Drosophila provenait de lieux afro-équatorials. Lorsque l’on étudie les rythmes circadiens, il y a une certaine phraséologie qu’il faut connaître. Pertinent à ce protocole, le moment où les lumières s’allument dans l’incubateur est défini comme zeitgeber temps 0 (ZT0) et toutes les autres fois sont par rapport à cette valeur (par exemple, dans un cycle de 12:12 LD, ZT12 est le moment où les lumières sont éteintes). Dans des conditions standard de 12:12 LD, le type sauvage Drosophila melanogaster présente généralement deux épisodes d’activité; l’un centré autour de ZT0 appelé « matin » pic et un autre autour de ZT12 appelé « soir » pic (Figure 1A). Les combats du matin et du soir sont contrôlés par l’horloge endogène, mais il ya aussi des réponses « sursaut » qui sont transitoires rafales d’activité en réponse aux transitions lumière / obscurité. Deux jours d’entraînement est le minimum et pourrait être utilisé, par exemple, dans de grands écrans qui prennent plus de temps et sont orientés vers la mesure des périodes de libre circulation dans l’obscurité constante (voir ci-dessous, étape 2). Toutefois, si vous êtes intéressé à étudier les modèles d’activité au cours d’un cycle quotidien lumière-obscurité, il est préférable de maintenir les mouches pendant 4-5 jours en LD afin d’obtenir plus de données. Essentiellement, l’augmentation du nombre de mouches ou du nombre de jours de LD dans l’analyse finale des données (p. ex., données de mise en commun des deux derniers jours d’activité locomotrice de la DL) générera des profils et des mesures d’activité diurne plus fiables (p. ex., le moment du pic du matin ou du soir). En outre, la répartition quotidienne de l’activité varie en fonction de la durée de la journée (photopériode) et de la température. Une raison majeure pour modifier la photopériod ou la température de la norme est si l’on voulait étudier comment les modèles d’activité quotidienne subissent une adaptation saisonnière (par exemple Chen et coll., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). La drosophile peut également être entraînée aux cycles de température quotidiens (p. ex. Glaser et Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et coll., Neuron (2009)). Les cycles de température qui ne varient que de 2-3 °C sont suffisants pour entrainer les rythmes d’activité.
2. Les rythmes d’activité locomoteurs en cours d’exécution libre sont mesurés dans des conditions d’obscurité et de température constantes après la fin de la période d’entraînement (voir ci-dessus, étape 1). Le réglage du cycle lumineux peut être modifié à tout moment dans la phase sombre le dernier jour de LD de sorte que le jour suivant de l’expérience représente le premier jour de DD. Sept jours de collecte de données DD sont suffisants pour calculer la période circadienne et l’amplitude (par exemple, la puissance ou la force du rythme) des mouches. En général, un échantillon d’au moins 16 mouches est nécessaire pour obtenir des périodes de libre circulation fiables pour un génotype particulier. Même si l’on ne s’intéresse qu’à la mesure de l’activité diurne, il est toujours préférable de mesurer les périodes de libre fonctionnement des mouches en DD, car les changements dans la période endogène peuvent modifier la distribution quotidienne de l’activité en LD. Par exemple, les mouches ayant de longues périodes endogènes présentent habituellement des pics retardés en soirée en LD (p. ex., voir la figure 2).
3. À la fin de l’expérience, les données binaires brutes recueillies à l’aide du logiciel DAM System sont téléchargées sur un périphérique de stockage de données portable, par exemple une clé USB.
4. Les données binaires brutes sont traitées à l’aide de DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) et résumées en bacs de 15 et 30 minutes lors de l’analyse des paramètres circadiens, ou des bacs de 1 à 5 minutes lors de l’analyse des paramètres veille/repos. À l’heure actuelle, cinq minutes contiguës d’inactivité sont la définition standard du sommeil et du repos à Drosophila (Hendricks et coll., Neuron (2000); Ho et Sehgal, Methods Enzymol., (2005)).
5. Il existe de nombreuses façons d’analyser les données recueillies sur le système DAM, mais nous ne fournirons que les méthodes couramment utilisées dans notre laboratoire. Microsoft Excel est utilisé pour attribuer le génotype à différents groupes d’échantillons. FaasX software (M. Boudinot et F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, France) ou Insomniac (programme basé sur Matlab; Leslie Ashmore, Université de Pittsburgh, PA) sont utilisés pour examiner les paramètres circadiens (p. ex. période et puissance) ou de sommeil/repos (p. ex. pourcentage de sommeil, durée moyenne des épisodes de repos) respectivement.

Representative Results

Figure 1 : Graphiques d’éduction générés à l’aide du FaasX montrant des rythmes d’activité locomoteurs quotidiens de mouches rythmiques de type sauvage (w pour⁰ mouches transportant un transgène per+ ) (A et B) par rapport à l’arrhythmie w pour⁰ mutants (C et D). Les mouches mâles ont été maintenues à 25 °C et entraînées pendant 4 jours en cycles de 12:12 LD (lumière : foncé) suivis de sept jours en DD (obscurité constante). Pour chaque ligne de vol, les niveaux d’activité locomoteur des mouches individuelles (n>32) ont été mesurés dans des bacs de 15 minutes, puis en moyenne pour obtenir un représentant du profil de groupe pour cette ligne. A et C montrent les données d’activité générées à partir de la moyenne des deuxième et troisième jours dans le cycle lumière/obscurité (LD 2-3) tandis que B et D montrent les données d’activité générées à partir de la moyenne des deuxième et troisième jours dans l’obscurité constante (DD 2-3). Les barres verticales représentent l’activité (en unités arbitraires) enregistrée dans des bacs de 15 minutes pendant la période de lumière (gris clair) ou la période sombre (gris foncé). Barres horizontales au bas des graphiques d’éduction LD; blanc, les lumières allumées; noir, les lumières éteintes. ZT0 et ZT12 représentent respectivement le début et la fin de la photopériod. Pour les graphiques d’éduction DD; CT0 et CT12 représentent le début et la fin de la journée subjective dans des conditions sombres constantes, indiquées par la barre grise. Dans le panneau A, M = pic du matin; E = pic du soir. Les flèches du panneau A représentent un comportement anticipé des pics matin et soir observés chez les mouches sauvages, qui sont absentes chez les mouches arythmiques w per^0. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Actogramme à double intrigue généré à l’aide du logiciel FaasX illustrant les données d’activité locomotrice des mouches de type sauvage, à courte ou longue période. Les mouches mâles ont été maintenues à 25 °C et entraînées pendant 4 jours en cycles de 12:12 LD suivis de huit jours dans l’obscurité constante (DD) pour le calcul de la période de fonctionnement libre (t) à l’aide du cycle-P dans faasx. Trois lignes de mouche avec la période sauvage de type [w par⁰; per+; par⁰ mutant transportant par+ transgène], longue période [w pour⁰; per(S47A); par⁰ mutant transportant per(S47A) transgene], et court laps de temps [w pour⁰; per(S47D); par⁰ mutant transportant per (S47D) transgene] sont montrés ici (Chiu et autres 2008). L’axe X représente le temps ZT ou CT en LD ou DD respectivement, et l’axe Y représente le nombre d’activités (unités arbitraires) résumé en bacs de 15 minutes. Les lignes pointillées rouges relient les sommets du soir pour chaque jour des expériences. Notez que pendant LD, le pic du soir est « forcé » de maintenir la synchronie avec le cycle LD de 24 heures, tandis qu’en DD la période de libre fonctionnement peut s’écarter de 24 heures. Par exemple, pour les mouches ayant de courtes périodes, le moment de l’activité du soir se produira plus tôt chaque jour consécutif en DD (lorsqu’il est tracé sur une échelle de temps de 24 heures, comme indiqué ici), tandis qu’un déplacement vers la droite est observé pour les mouches avec de longues périodes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014