Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

דרוזופילה (לא כולל) צג פעילות (DAM): שיטה למדידת פעילות לוקומוטור בזבובים

Overview

סרטון וידאו זה מתאר את מערכת צג הפעילות של דרוזופילה (DAM) המשמשת למעקב אחר פעילות לוקומוטור. חוקרים משתמשים בנתוני פעילות שנאספו מה-DAM כדי לחקור מקצבים צירקדיים בזבובי פירות. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לטעון זבובים במכשיר ולתעד נתוני פעילות לניסויים ביולוגיים.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Chiu et al., Assaying פעילות לוקומוטור ללמוד מקצבים צירקדיים ופרמטרים שינה ב Drosophila, J. Vis. Exp. (2010).

1. טעינת זבובים לתוך צינורות פעילות ומערכת ניטור פעילות לוקומוטור

  1. לפני טעינת זבובים לצינורות פעילות, הפעילו את האינקובטורים שישמשו לאכלס את צגי הפעילות. כוונן את הטמפרטורה באמצעות פקדי החממה והגדר את משטר האור/כהה באמצעות בקר האור של מערכת DAM או החממות בעלות מערכת בקרת אור בהתאם לתכנון הניסיוני הרצוי. הזמן הדרוש כדי לטעון זבובים לתוך צינורות פעילות צריך להיות מספיק עבור הטמפרטורה להתייצב.
  2. המשך את הזבובים עם פחמן דו חמצני.
  3. השתמש במברשת צבע עדינה כדי להעביר בעדינות זבוב בודד לתוך צינור פעילות.
  4. תפוס את האמצע של חתיכה אחת של חוט כי הוא סביב חצי אינץ 'עם מלקחיים עדינים ולהכניס את חוט לתוך קצה שאינו מזון של צינור הפעילות כדי לחבר את הפתח ולמנוע את הזבוב לברוח במהלך הניסוי, תוך מתן אפשרות זרימת אוויר לתוך הצינור. לחלופין, ניתן להשתמש בכובעי פלסטיק עם חורים קטנים (Trikinetics, Inc. ) כדי לסגור את הפתח.
  5. ודא הצינורות מונחים על הצדדים שלהם עד הזבוב מתעורר, או אחר יש את הסיכון של הזבוב להידבק למזון.
  6. הכנס את הצינורות לתוך צגי הפעילות. עם הדגם החדש והדחוס יותר של צגי Trikinetics (Trikinetics DAM2 ו- DAM2-7), יש צורך להחזיק את הצינורות במקום עם גומיות כדי להבטיח שקרן האינפרא-אדום תעבור את הצינור במיקום המרכזי.
  7. מכניסים את צגי הפעילות לאינקובטורים ומחברים אותם למערכת איסוף הנתונים באמצעות חוטי הטלפון. בדוק באמצעות תוכנת איסוף מערכת DAM כדי לוודא שכל הצגים מחוברים כראוי ונתונים נאספים מכל אחד מהם. הצג פולט קרן אור אינפרא אדום על פני מרכז כל צינור פעילות זכוכית. פעילות הלוקומוטור של הזבובים נרשמת כנתונים בינאריים גולמיים שבהם "אחד" נרשם בכל פעם שקרן האינפרא-אדום שבורה או 'אפס' נרשם שבו קרן האינפרא-אדום אינה שבורה.

2. תכנון ניסיוני לרישום נתונים לקביעת המחזוריות והאמפליטיות הצירקדית

  1. זבובים מסונכרנים ומופצים על ידי חשיפתם למשטר האור/כהה (LD) והטמפרטורה הרצויים למשך 2-5 ימים מלאים. מצב הכניסה הנפוץ ביותר הוא מחזור בהיר /כהה של 12 שעות אור / 12 שעות כהה (12:12 LD) ב 25 °C (69 °F). מצב סטנדרטי מקובל זה מבוסס בעיקרו על המחשבה כי Drosophila מקורו במקומות אפרו-קו המשווה. כאשר לומדים מקצבים צירקדיים יש כמה ביטויים כי אחד צריך להכיר. רלוונטי לפרוטוקול זה, הזמן שבו האורות נדלקים באינקובטור מוגדר כזמן צייטגבר 0 (ZT0) וכל הזמנים האחרים הם יחסיים לערך זה (למשל, במחזור LD 12:12, ZT12 הוא הזמן שבו האורות כבויים). תחת תנאי LD סטנדרטיים 12:12, סוג פראי Drosophila melanogaster בדרך כלל להפגין שני התקפי פעילות; אחד מרוכז סביב ZT0 נקרא "בוקר" שיא ועוד סביב ZT12 כינה "ערב" שיא(איור 1A). התקפי הבוקר והערב נשלטים על ידי השעון האנדוגני אך יש גם תגובות "מבהילות" שהן התפרצויות חולפות של פעילות בתגובה למעברים הבהירים / כהים. יומיים של כניסה הוא המינימום והוא יכול לשמש, למשל, במסכים גדולים כי הם יותר זמן רב והם מכוונים למדידת תקופות ריצה חופשית בחושך מתמיד (ראה להלן, שלב 2). עם זאת, אם אתם מעוניינים ללמוד את דפוסי הפעילות במהלך מחזור אור כהה יומי, עדיף לשמור על הזבובים במשך 4-5 ימים ב- LD כדי להשיג נתונים נוספים. בעיקרו של דבר, הגדלת מספר הזבובים או מספר ימי LD בניתוח הנתונים הסופי (למשל, נתוני מאגר מהיומיים האחרונים של פעילות לוקומוטור LD) תיצור פרופילים ומדידות פעילות יומיים אמינים יותר (למשל, עיתוי שיא הבוקר או הערב). יתר על כן, ההתפלגות היומית של הפעילות משתנה כפונקציה של אורך יום (photoperiod) וטמפרטורה. סיבה מרכזית לשינוי הפוטופריוד או הטמפרטורה מהתקן היא אם רוצים ללמוד כיצד דפוסי הפעילות היומיומיים עוברים הסתגלות עונתית (למשל חן ואח ', קולד ספרינג חרב סימף קוואנט ביול. (2007)). Drosophila יכול להיות גם entrained מחזורי טמפרטורה יומיים (למשל גלזר סטנובסקי, קור Biol. (2005); סהדובה ואח ', נוירון (2009)). מחזורי טמפרטורה המשתנים על ידי רק 2-3 מעלות צלזיוס מספיקים כדי entrain מקצבי פעילות.
  2. מקצבי פעילות לוקומוטור ריצה חינם נמדדים בתנאים כהים וטמפרטורה קבועים לאחר סיום תקופת הכניסה (ראה לעיל, שלב 1). ניתן לשנות את ההגדרה של מחזור האור בכל עת בשלב החשוך ביום האחרון של LD כך שהיום הבא של הניסוי מייצג את היום הראשון של DD. שבעה ימים של איסוף נתוני DD מספיקים כדי לחשב את התקופה הביולוגית ואת משרעת (למשל, כוח או כוח של קצב) של זבובים. באופן כללי, גודל מדגם של לפחות 16 זבובים יש צורך להשיג תקופות ריצה חופשית אמינה עבור גנוטיפ מסוים. גם אם אדם מעוניין רק במדידת פעילות יומית, עדיין עדיף למדוד את תקופות הריצה החופשית של הזבובים ב- DD מכיוון ששינויים בתקופה אנדוגנית יכולים לשנות את ההפצה היומית של הפעילות ב- LD. לדוגמה, זבובים עם תקופות אנדוגניות ארוכות מציגים בדרך כלל פסגות ערב מעוכבות ב- LD (לדוגמה, ראה איור 2).
  3. בסיום הניסוי, נתונים בינאריים גולמיים שנאספו באמצעות תוכנת מערכת DAM מורדים להתקן אחסון נתונים נייד, למשל מפתח USB.
  4. הנתונים הבינאריים הגולמיים מעובדים באמצעות DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc. ) ומסוכמים לפחים של 15 ו-30 דקות בעת ניתוח פרמטרים צירקדיים, או סלים של דקה עד חמש דקות בעת ניתוח פרמטרי שינה/מנוחה. נכון לעכשיו, חמש דקות רצופות של חוסר פעילות היא ההגדרה הסטנדרטית של שינה / מנוחה ב Drosophila (הנדריקס ואח ', נוירון (2000); הו וסגל, שיטות אנזימול, (2005)).
  5. ישנן דרכים רבות ושונות לנתח את הנתונים שנאספו על מערכת DAM אבל אנחנו רק לספק שיטות אלה בשימוש שגרתי במעבדה שלנו. Microsoft Excel משמש להקצאת גנוטיפ לקבוצות לדוגמה שונות. תוכנת FaasX (M. Boudinot ו- F. Rouyer, מרכז לאומי דה לה Recherche Scientifique, גיף-סור-איווט Cedex, צרפת) או נדודי שינה (תוכנית מבוססת Matlab; לסלי אשמור, אוניברסיטת פיטסבורג, הרשות הפלסטינית) משמשים לבדיקת פרמטרים צירקדיים (למשל תקופה וכוח) או שינה/מנוחה (למשל אחוז שינה, ממוצע אורך התקף מנוחה) בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
איור 1: גרפים של Eduction שנוצרו באמצעות FaasX המציגים מקצבי פעילות לוקומוטור יומיים של זבובים מסוג פראי קצבי (w לכל0 זבובים הנושאים טרנסג'ין לכל+ ) (A ו- B) לעומת הפרעות קצב w לכל 0 מוטנטים (C ו- D). זבובים זכרים הוחזקו ב 25 מעלות צלזיוס ו entrained במשך 4 ימים ב 12:12 LD (אור: כהה) מחזורים ואחריו שבעה ימים DD (חושך מתמיד). עבור כל קו טיסה, רמות הפעילות של locomotor של זבובים בודדים (n>32) נמדדו בפחים של 15 דקות ולאחר מכן בממוצע כדי להשיג נציג פרופיל קבוצה עבור קו זה. A ו- C מציגים את נתוני הפעילות הנוצרים מממוצע הימים השני והשלישי במחזור אור/כהה (LD 2-3) בעוד ש- B ו- D מציגים את נתוני הפעילות הנוצרים מהממוצע של הימים השני והשלישי בחושך מתמיד (DD 2-3). פסים אנכיים מייצגים את הפעילות (ביחידות שרירותיות) שתועדה בפחים של 15 דקות במהלך תקופת האור (אפור בהיר) או התקופה הכהה (אפור כהה). פסים אופקיים בתחתית תרשימי duction LD; לבן, אורות דולקים; שחור, כיבוי אורות. ZT0 ו ZT12 מייצגים את ההתחלה והסוף של photoperiod בהתאמה. לתרשימי eduction של DD; CT0 ו- CT12 מייצגים את ההתחלה והסיום של היום הסובייקטיבי בתנאים כהים קבועים, המסומנים על ידי הסרגל האפור. בפאנל A, M = שיא בוקר; E = שיא הערב. החצים בלוח A מייצגים התנהגות צפוית של פסגות בוקר וערב שנצפו בזבובים מסוג בר, הנעדרים בזבובים הפרעות קצב w לכל0 הפרעות קצב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אקטוגרמה של התוויה כפולה שנוצרה באמצעות תוכנת FaasX הממחישה נתוני פעילות לוקומוטורית של זבובים עם סוג פראי, תקופה קצרה או ארוכה. זבובים זכרים נשמרו ב 25 °C (69 °F) ו entrained במשך 4 ימים ב 12:12 מחזורי LD ואחריו שמונה ימים בחושך מתמיד (DD) לחישוב של תקופת ריצה חופשית (t) באמצעות מחזור-P ב FaasX. שלושה קווי זבוב עם תקופת סוג פראי [w לכל0;לכל +; לכל0 מוטנטים הנושאים לכל+ טרנסג'ין], תקופה ארוכה [w לכל0; לכל(S47A); לכל0 מוטנטים הנושאים טרנסג'ין (S47A) ], ותקופה קצרה [w לכל0; לכל(S47D); לכל0 מוטנטים הנושאים טרנסג'ין (S47D) מוצגים כאן (Chiu et al. 2008). ציר X מייצג זמן ZT או CT ב- LD או DD בהתאמה, וציר Y מייצג ספירות פעילויות (יחידות שרירותיות) המסוכמים לסלים של 15 דקות. הקווים האדומים המנוקדים מחברים את פסגות הערב לכל יום של הניסויים. שים לב כי במהלך LD שיא הערב הוא 'נאלץ' כדי לשמור על synchrony עם מחזור LD 24 שעות ביממה, ואילו ב DD תקופת ריצה חופשית יכול לסטות מ 24 שעות. לדוגמה, עבור זבובים עם תקופות קצרות העיתוי של פעילות הערב יתרחש מוקדם יותר בכל יום רצוף ב- DD (כאשר התווה כנגד סרגל זמן של 24 שעות, כפי שמוצג כאן), ואילו מעבר ימינה נצפה עבור זבובים עם תקופות ארוכות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drosophila activity monitor (DAM) Trikinetics Inc.; Waltham, MA DAM2 or DAM5 DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system) Trikinetics Inc.; Waltham, MA PSIU9 Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller Trikinetics Inc.; Waltham, MA LC6
Pyrex glass tubes Trikinetics Inc.; Waltham, MA PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps Trikinetics Inc.; Waltham, MA CAP5 Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software Trikinetics Inc.; Waltham, MA Versions available for both Mac and PC
FaasX software Centre National de la Recherche Scientifique Only for Mac
Insomniac 2.0 software University of Pittsburgh School of Medicine Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator Percival Scientific, Inc. I-30BLL Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature Tritech Research, Inc. 05DT2CIRC001 Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit) APC SU2200NET Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Bacto Agar BD Biosciences 214010
TissuePrep Paraffin pellets Fisher Scientific T565 Melting point 56 °C-57 °C
Block heater VWR international 12621-014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

ערך ריק הנפקה
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter