Drosofilia Activity Monitor (DAM): un metodo per misurare l'attività locomotoria nelle mosche

Overview

Questo video descrive il sistema dam (Drosophila activity monitor) utilizzato per tracciare l'attività locomotoria. I ricercatori utilizzano i dati di attività raccolti dal DAM per studiare i ritmi circadiani nei moscerini della frutta. La clip del protocollo in primo piano mostra come caricare mosche nel dispositivo e registrare i dati di attività per gli esperimenti circadiani.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Chiu et al., Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila,J. Vis. Exp. 

1. Caricamento di mosche in tubi di attività e sistema di monitoraggio dell'attività locomotoria

1. Prima di caricare le mosche in tubi di attività, accendere gli incubatori che verranno utilizzati per ospitare i monitor di attività. Regolare la temperatura utilizzando i comandi dell'incubatore e impostare il regime luce/buio utilizzando il controller di luce DAM System o il proprio sistema di controllo della luce degli incubatori in base al design sperimentale desiderato. Il tempo necessario per caricare le mosche nei tubi di attività dovrebbe essere sufficiente per stabilizzare la temperatura.
2. Anestetizza le mosche con anidride carbonica.
3. Utilizzare un pennello fine per trasferire delicatamente una singola mosca in un tubo di attività.
4. Afferrare il centro di un singolo pezzo di filato che è di circa mezzo pollice con forcep fini e inserire il filato nell'estremità non alimentare del tubo di attività per tappare l'apertura e impedire alla mosca di fuoriuscire durante l'esperimento, consentendo allo stesso tempo il flusso d'aria nel tubo. In alternativa, i tappi di plastica con piccoli fori (Trikinetics, Inc.) possono essere utilizzati per chiudere l'apertura.
5. Assicurati che i tubi siano posati sui loro lati fino a quando la mosca non si sveglia, altrimenti c'è il rischio che la mosca si blocchi al cibo.
6. Inserire i tubi nei monitor di attività. Con il modello più nuovo e compatto dei monitor Trikinetics (Trikinetics DAM2 e DAM2-7), è necessario tenere i tubi in posizione con elastici per garantire che il fascio infrarosso passi il tubo nella posizione centrale.
7. Inserire i monitor di attività negli incubatori e collegarli al sistema di raccolta dati tramite i fili telefonici. Controllare utilizzando il software di raccolta DAM System per assicurarsi che tutti i monitor siano agganciati correttamente e che i dati vengano raccolti da ciascuno di essi. Il monitor emette fascio di luce infrarossa attraverso il centro di ogni tubo di attività del vetro. L'attività locomotoria delle mosche è registrata come dati binari grezzi in cui "uno" viene registrato ogni volta che il fascio infrarosso viene rotto o viene registrato uno 'zero' in cui il fascio infrarosso non è rotto.

2. Progettazione sperimentale per registrare i dati per la determinazione della periodicità e dell'ampiezza circadiana

1. Le mosche vengono sincronizzate e intrappolate esponendole alla luce / buio (LD) desiderata e al regime di temperatura per 2-5 giorni completi. La condizione di intrappolamento più comunemente usata è un ciclo chiaro/scuro di 12 ore di luce / 12 ore scure (12:12 LD) a 25 °C. Questa condizione standard generalmente accettata si basa essenzialmente sul pensiero che la Drosophila abbia avuto origine da località afro-equatoriali. Quando si studiano i ritmi circadiani c'è una fraseologia che si deve familiarizzare con. Rilevante per questo protocollo, il momento in cui le luci si accese nell'incubatore è definito come zeitgeber tempo 0 (ZT0) e tutte le altre volte sono relative a quel valore (ad esempio, in un ciclo LD 12:12, ZT12 è il momento in cui le luci sono spente). In condizioni standard di LD 12:12, il tipo selvaggio Drosophila melanogaster mostra tipicamente due attacchi di attività; uno incentrato su ZT0 definito picco "mattutino" e un altro intorno zt12 definito picco "serale"(Figura 1A). Gli attacchi mattutini e serali sono controllati dall'orologio endogeno ma ci sono anche risposte "startle" che sono raffiche transitorie di attività in risposta alle transizioni luce / buio. Due giorni di intrappolamento sono i minimi e potrebbero essere utilizzati, ad esempio, in schermi di grandi dimensioni che richiedono più tempo e sono orientati a misurare i periodi di corsa libera nell'oscurità costante (vedi sotto, passaggio 2). Tuttavia, se sei interessato a studiare i modelli di attività durante un ciclo quotidiano luce-buio, è preferibile mantenere le mosche per 4-5 giorni in LD in modo da ottenere più dati. In sostanza, l'aumento del numero di mosche o del numero di giorni LD nell'analisi dei dati finali (ad esempio, i dati del pool degli ultimi due giorni di attività locomotoria LD) genererà profili e misurazioni di attività diurne più affidabili (ad esempio, tempistiche del picco mattutino o serale). Inoltre, la distribuzione giornaliera dell'attività varia in funzione della durata del giorno (fotoperiodo) e della temperatura. Una delle ragioni principali per alterare il fotoperiodo o la temperatura dallo standard è se si voleva studiare come i modelli di attività quotidiana subiscono l'adattamento stagionale (ad esempio Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). La Drosophila può anche essere intrappolata nei cicli di temperatura giornalieri (ad esempio Glaser e Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). I cicli di temperatura che variano solo di 2-3 °C sono sufficienti per intrappolare i ritmi di attività.
2. I ritmi di attività locomotore a corsa libera sono misurati in condizioni di buio e temperatura costanti al termine del periodo di intrappolamento (vedi sopra, fase 1). L'impostazione per il ciclo della luce può essere modificata in qualsiasi momento nella fase oscura l'ultimo giorno di LD in modo tale che il giorno successivo dell'esperimento rappresenti il primo giorno di DD. Sette giorni di raccolta dei dati DD sono sufficienti per calcolare il periodo circadiano e l'ampiezza (ad esempio, potenza o forza del ritmo) delle mosche. In generale, una dimensione del campione di almeno 16 mosche è necessaria per ottenere periodi di corsa libera affidabili per un particolare genotipo. Anche se si è interessati solo a misurare l'attività diurna, è comunque meglio misurare i periodi di corsa libera delle mosche in DD in quanto i cambiamenti nel periodo endogeno possono alterare la distribuzione giornaliera dell'attività in LD. Ad esempio, le mosche con lunghi periodi endogeni di solito mostrano picchi serali ritardati in LD (ad esempio, vedi figura 2).
3. Al termine dell'esperimento, i dati binari grezzi raccolti utilizzando il software DAM System vengono scaricati su un dispositivo di archiviazione dati portatile, ad esempio la chiave USB.
4. I dati binari non elaborati vengono elaborati utilizzando DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) e sommati in contenitori di 15 e 30 minuti quando si analizzano i parametri circadiani o contenitori da 1 a 5 minuti quando si analizzano i parametri di sospensione/riposo. Attualmente, cinque minuti contigui di inattività è la definizione standard di sonno/riposo in Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho and Sehgal, Methods Enzymol., (2005)).
5. Esistono molti modi diversi per analizzare i dati raccolti sul sistema DAM, ma forniremo solo quei metodi utilizzati abitualmente nel nostro laboratorio. Microsoft Excel viene utilizzato per assegnare il genotipo a gruppi di esempio diversi. Software FaasX (M. Boudinot e F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Francia) o Insomniac (programma basato su Matlab; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) sono usati per esaminare rispettivamente i parametri circadiani (ad esempio periodo e potenza) o sonno/riposo (ad esempio sonno percentuale, lunghezza media dell'incontro di riposo).

Representative Results

Figura 1: Grafici di eduzione generati utilizzando FaasX che mostrano i ritmi di attività locomotoria giornaliera delle mosche ritmiche di tipo selvaggio (w per⁰ mosche che trasportano un transgene per + ) (A e B) rispetto all'aritmico w per⁰ mutanti (C e D). Le mosche maschili sono state mantenute a 25 °C e intrappolate per 4 giorni in cicli 12:12 LD (chiaro: scuro) seguite da sette giorni in DD (oscurità costante). Per ogni linea di volo, i livelli di attività locomotore delle singole mosche (n>32) sono stati misurati in bidoni di 15 minuti e quindi mediati per ottenere un profilo di gruppo rappresentativo per quella linea. A e C mostrano i dati di attività generati dalla media del secondo e del terzo giorno in ciclo luce/buio (LD 2-3) mentre B e D mostrano i dati di attività generati dalla media del secondo e del terzo giorno in costante oscurità (DD 2-3). Le barre verticali rappresentano l'attività (in unità arbitrarie) registrata in bidoni di 15 minuti durante il periodo chiaro (grigio chiaro) o il periodo buio (grigio scuro). Barre orizzontali nella parte inferiore dei grafici di eduzione LD; bianco, luci accese; ZT0 e ZT12 rappresentano rispettivamente l'inizio e la fine del fotoperiodo. Per i grafici di eduzione DD; CT0 e CT12 rappresentano l'inizio e la fine della giornata soggettiva in condizioni di buio costante, indicato dalla barra grigia. Nel pannello A, M = picco mattutino; E = picco serale. Le frecce nel pannello A rappresentano il comportamento anticipatore dei picchi mattutini e serali osservati nelle mosche di tipo selvaggio, che sono assenti in w per⁰ mosche aritmiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Actogramma a doppio grafico generato utilizzando il software FaasX che illustra i dati sull'attività locomotoria delle mosche con tipo selvaggio, breve o lungo periodo. Le mosche maschili sono state tenute a 25 °C e intrappolate per 4 giorni in cicli LD 12:12 seguite da otto giorni in costante oscurità (DD) per il calcolo del periodo di corsa libera (t) utilizzando Cycle-P in FaasX. Tre linee di volo con periodo di tipo jolly [w per⁰; per+; per⁰ mutante che trasporta per+ transgene], lungo periodo [w per⁰; per(S47A); per⁰ mutante portatore per(S47A) transgene] e breve periodo [w per⁰; per(S47D); per⁰ mutante che trasporta per (S47D) transgene] sono mostrati qui (Chiu et al. 2008). L'asse X rappresenta rispettivamente il tempo ZT o CT in LD o DD e l'asse Y rappresenta i conteggi delle attività (unità arbitrarie) sommati in collocazioni di 15 minuti. Le linee tratteggiate rosse collegano i picchi serali per ogni giorno degli esperimenti. Si noti che durante l'LD il picco serale è "costretto" a mantenere la sincronia con il ciclo LD di 24 ore, mentre in DD il periodo di corsa libera può deviare da 24 ore. Ad esempio, per le mosche con brevi periodi il tempo dell'attività serale si verificherà prima in ogni giorno consecutivo in DD (se tracciato su una scala di tempo di 24 ore, come mostrato qui), mentre si osserva uno spostamento a destra per le mosche con lunghi periodi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014