드로소필라 활동 모니터(DAM): 파리의 운동 활동을 측정하는 방법

Overview

이 비디오는 운동 활동을 추적하는 데 사용되는 DROsophila 활동 모니터(DAM) 시스템을 설명합니다. 연구원은 과일 파리에서 circadian 리듬을 공부하기 위해 DAM에서 수집 된 활동 데이터를 사용합니다. 기능을 갖춘 프로토콜 클립은 장치에서 파리를 로드하고 circadian 실험에 대한 활동 데이터를 기록하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 Chiu 외에서발췌입니다 ., 드로소필라에서Circadian 리듬과 수면 매개 변수를 연구하는 로코모터 활동을 분석,J. Vis. Exp. (2010). 

1. 활동 튜브 및 운동 활동 모니터링 시스템으로 파리로 적재

1. 활동 튜브에 파리를 적재하기 전에 활동 모니터를 보관하는 데 사용되는 인큐베이터를 켭니다. 인큐베이터 컨트롤을 사용하여 온도를 조정하고 원하는 실험 설계에 따라 DAM 시스템 라이트 컨트롤러 또는 인큐베이터가 자체 광 제어 시스템을 사용하여 빛/어두운 정권을 설정합니다. 활동 튜브에 파리를 적재하는 데 필요한 시간은 온도가 안정화되기에 충분해야합니다.
2. 이산화탄소로 파리를 마취시합니다.
3. 미세한 페인트 브러시를 사용하여 단일 플라이를 활동 튜브로 부드럽게 전송합니다.
4. 미세 한 집게로 반 인치 정도인 원사의 중간을 잡고 원사를 활동 튜브의 비식품 끝에 삽입하여 개구부를 연결하고 실험 중에 비행이 빠져나가는 것을 방지하는 동시에 튜브로 공기 흐름을 허용합니다. 또는 작은 구멍이있는 플라스틱 캡 (Trikinetics, Inc.)을 사용하여 개구부를 닫을 수 있습니다.
5. 비행이 깨어날 때까지 튜브가 측면에 놓여 있는지 확인하거나, 그렇지 않으면 음식이 붙어있을 위험이 있습니다.
6. 활동 모니터에 튜브를 삽입합니다. 삼지연관 모니터(Trikinetics DAM2 및 DAM2-7)의 새롭고 컴팩트한 모델을 통해 적외선 빔이 중앙 위치에서 튜브를 통과할 수 있도록 고무 대역으로 튜브를 제자리에 고정할 필요가 있습니다.
7. 활동 모니터를 인큐베이터에 넣고 전화선을 통해 데이터 수집 시스템에 연결합니다. DAM System 수집 소프트웨어를 사용하여 모든 모니터가 제대로 연결되고 각 모니터에서 데이터가 수집되는지 확인합니다. 모니터는 각 유리 활동 튜브의 중앙을 가로 질러 적외선 빔을 방출합니다. 파리의 운동 활동은 적외선 빔이 파손되거나 적외선 빔이 파손되지 않는 '0'이 기록될 때마다 "하나"가 기록되는 원시 바이너리 데이터로 기록됩니다.

2. Circadian 주기및 진폭의 측정을 위한 데이터를 기록하는 실험 설계

1. 파리는 2-5일 동안 원하는 빛/어두운(LD) 및 온도 정권에 노출시킴으로써 동기화되고 훈련됩니다. 가장 일반적으로 사용되는 실내 학습 조건은 25 °C에서 12 시간 광 / 12 시간 어두운 (12:12 LD)의 빛 / 어두운 주기입니다. 이 일반적으로 허용 된 표준 조건은 본질적으로 드로소필라 아프로 적도 위치에서 유래 한 생각에 근거. circadian 리듬을 공부 할 때 하나는 익숙해해야 몇 가지 문구가있다. 이 프로토콜과 관련, 인큐베이터에서 조명이 켜지는 시간은 zeitgeber 시간 0(ZT0)으로 정의되고 다른 모든 시간은 그 값에 상대적입니다(예를 들어, 12:12 LD 주기에서 ZT12는 조명이 꺼지는 시간)입니다. 표준 12:12 LD 조건하에서, 야생 형 Drosophila 멜라노가스터는 일반적으로 활동의 두 시합을 전시; ZT0을 중심으로 "아침"피크라고 불리는 것과 ZT12 주변의 다른 하나는 "저녁"피크(그림 1A)라고합니다. 아침과 저녁 시합은 내인성 시계에 의해 제어되지만 빛 / 어두운 전환에 대한 응답으로 일시적인 활동의 버스트인 "깜짝"응답도 있습니다. 2일간의 감발은 최소이며, 예를 들어 시간이 많이 걸리고 일정한 어둠 속에서 자유 실행 기간을 측정하는 방향으로 준비된 대형 스크린에서 사용할 수 있습니다(아래 참조, 2단계 참조). 그러나, 매일 밝은 어두운 주기 동안 활동 패턴을 연구하는 데 관심이 있다면, 더 많은 데이터를 얻기 위해 LD에서 4-5 일 동안 파리를 유지하는 것이 바람직하다. 본질적으로 최종 데이터 분석에서 파리 수 또는 LD 일 수를 늘리면(예: 지난 이틀 동안 LD 운동 활동에서 풀 데이터)이 보다 신뢰할 수 있는 주전자 활동 프로필 및 측정(예: 아침 또는 저녁 피크의 타이밍)을 생성합니다. 또한, 활동의 일일 분포는 하루 길이 (photoperiod) 및 온도의 함수에 따라 다릅니다. 표준에서 포토기간이나 온도를 변경하는 주된 이유는 일상 활동 패턴이 계절적 적응을 어떻게 겪는지 연구하고 싶다면(예: 첸 등, 콜드 스프링 하프 심프 퀀트 바이오올)을 연구하고 싶기 때문입니다. (2007). 드로소필라는 또한 매일 온도 주기(예: Glaser 및 스타뉴스키, 커 비올)에 교제될 수 있다. (2005); 세하도바 외, 뉴런 (2009). 2-3°C에 만 변화하는 온도 주기는 활동 리듬을 훈련하기에 충분합니다.
2. 무료 달리기 운동 활동 리듬은 연수 기간이 끝난 후 일정한 어둡고 온도 조건에서 측정됩니다(위 참조, 1단계 참조). 광사이클에 대한 설정은 LD의 마지막 날에 어두운 상에서 언제든지 변경될 수 있으며, 실험의 후속 일은 DD의 첫날을 나타내며 DD 데이터 수집의 7일은 파리의 일주기 및 진폭(예를 들어, 전력 또는 리듬의 강도)을 계산하기에 충분합니다. 일반적으로 특정 유전자형에 대해 신뢰할 수 있는 자유 실행 기간을 얻기 위해서는 최소 16개의 파리 샘플 크기가 필요합니다. 동구 활동 측정에만 관심이 있더라도 내인성 기간의 변화가 LD에서 의 일일 활동 분포를 바꿀 수 있으므로 DD에서 파리의 자유 실행 기간을 측정하는 것이 가장 좋습니다. 예를 들어, 긴 내인성 기간을 가진 파리는 일반적으로 LD에서 지연된 저녁 피크를 나타낸다(예: 그림 2참조).
3. 실험이 끝나면 DAM System 소프트웨어를 사용하여 수집된 원시 바이너리 데이터를 USB 키와 같은 휴대용 데이터 저장 장치에 다운로드합니다.
4. 원시 바이너리 데이터는 DAM Filescan102X(Trikinetics, Inc.)를 사용하여 처리되며 circadian 매개 변수를 분석할 때 15 분 및 30 분 쓰레기통으로 요약되거나 수면 / 휴식 매개 변수를 분석 할 때 1 ~ 5 분 쓰레기통으로 요약됩니다. 현재, 비활성의 5 개의 연속 분 드로소 필라에서 수 면/휴식의 표준 정의 (헨드릭스 등., 뉴런 (2000); 호와 세갈, 방법 엔지몰., (2005).
5. DAM 시스템에서 수집된 데이터를 분석하는 방법에는 여러 가지가 있지만 랩에서 일상적으로 사용되는 메서드만 제공합니다. Microsoft Excel은 다른 샘플 그룹에 유전자형을 할당하는 데 사용됩니다. FaasX 소프트웨어 (M. 부디노와 F. 루이어, 센터 내셔널 드 라 레체르체 시엔티피크, 기쉬 쉬르 이벳 세덱스, 프랑스) 또는 불면증 (Matlab 기반 프로그램; 레슬리 애쉬모어, 피츠버그 대학, PA) circadian을 검사 하는 데 사용 (예를 들어. 기간 및 전원) 또는 수 면/휴식 (예를 들어 백분율 수 면, 평균 휴식 시합 길이) 매개 변수 각각.

Representative Results

그림 1: FaasX를 사용하여 생성된 유도그래프는 리듬형 야생형 파리의 일일 운동 활동 리듬(0파리당 0개당+트랜스진을 운반하는 파리)과 ^{0돌연변이당} 부정맥(C 및 D)을 통해 생성됩니다. 수컷 파리는 25°C에서 보관되었고 12:12 LD(빛: 어두운) 사이클에서 4일 동안 훈련을 받았으며, 그 다음으로 DD(일정한 어둠)에서 7일간 진행되었다. 각 플라이 라인에 대해 개별 플라이(n>32)의 운동 활동 수준을 15분 쓰레기통으로 측정한 다음 해당 선의 그룹 프로파일 담당자를 얻기 위해 평균화되었습니다. A와 C는 빛/암흑 주기(LD 2-3)에서 2일과 3일을 평균화하여 생성된 활동 데이터를 보여주고 B와 D는 일정한 어둠 속에서 2일과 3일을 평균화하여 생성된 활동 데이터를 보여준다(DD 2-3). 세로 막대는 라이트 기간(밝은 회색) 또는 어두운 기간(어두운 회색)동안 15분 동안 저장소에 기록된 활동(임의 단위)을 나타냅니다. LD 유도 그래프 의 하단에 수평 막대; 흰색, 조명 켜기; 검은색, 꺼진 ZT0 및 ZT12는 포토기간의 시작과 끝을 각각 나타냅니다. DD 유도 그래프의 경우; CT0 및 CT12는 회색 막대로 표시된 일정한 어두운 조건에서 주관적인 날의 시작과 끝을 나타냅니다. 패널 A, M = 아침 피크; E = 저녁 피크. 패널 A의 화살표는 야생 형 파리에서 관찰 되는 아침과 저녁 피크의 예상 동작을 나타냅니다., ⁰ 부정 맥 파리 당 w에 없는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 야생형, 짧거나 긴 기간동안 파리의 운동 활성 데이터를 보여주는 FaasX 소프트웨어를 사용하여 생성된 이중 플롯 actogram. 수컷 파리는 25°C에서 유지되었고, 12:12 LD 사이클에서 4일 동안 훈련을 받았으며, FaasX에서 Cycle-P를 사용하여 자유 실행 기간(t)을 계산하기 위해 8일간 일정한 어둠(DD)에서 8일 동안 훈련을 받았다. 야생 유형 기간 ^[0당w ; 당 +)를 가진 세 개의 비행 라인; + 트랜스진 당 운반 ⁰ 돌연변이당], 긴 기간 ^[0당w ; 당 (S47A); (S47A) 트랜스진당 ^{운반돌연변이0당,} 짧은 기간 ^[0당w; 당 S47D); (S47D) 트랜스진당 0돌연변이체운반이 여기에 도시되어 있다(Chiu et al. 2008). X축은 LD 또는 DD에서 각각 ZT 또는 CT 시간을 나타내며 Y축은 15분 빈으로 합산된 활동 수(임의 단위)를 나타냅니다. 빨간색 점선은 실험의 매일 저녁 피크를 연결합니다. LD 기간 동안 저녁 피크는 24 시간 LD 주기와 동기화를 유지하기 위해 '강제', DD에서 자유 실행 기간은 24 시간에서 벗어날 수 있습니다. 예를 들어, 짧은 기간의 파리의 경우 저녁 활동의 타이밍은 DD에서 매일 연속으로 발생합니다 (여기에 표시된 대로 24 시간 척도에 대해 플롯 될 때), 장기간 파리의 경우 오른쪽으로의 이동이 관찰됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014