Дрозофила Монитор активности (DAM): Метод измерения активности локомотива в мухах

Overview

Это видео описывает систему мониторинга активности Drosophila (DAM), используемую для отслеживания активности локомотива. Исследователи используют данные о активности, собранные из DAM для изучения циркадных ритмов у плодовых мушек. Клип с протоколом показывает, как загружать мухи в устройство и записывать данные о активности для циркадных экспериментов.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Chiu et al., анализ локомотивной активности для изучения циркадных ритмов и параметров сна в Drosophila, J. Vis. Exp. (2010).

1. Загрузка мух в трубы активности и систему мониторинга активности Локомотива

1. Перед загрузкой летит в деятельности труб, включите инкубаторы, которые будут использоваться для предварительного наблюдения деятельности. Отрегулируйте температуру с помощью управления инкубатором и установите режим света/темного режима с помощью светового контроллера DAM System ИЛИ инкубаторы владеют системой управления светом в соответствии с желаемой экспериментальной конструкцией. Времени, необходимого для загрузки мух в трубки активности, должно быть достаточно для стабилизации температуры.
2. Обезболивать мух углекислым газом.
3. Используйте тонкую кисть, чтобы аккуратно перенести одну муху в трубку активности.
4. Захватите середину одного куска пряжи, который составляет около половины дюйма с тонкой типсов и вставить пряжу в непродовольственный конец деятельности трубки, чтобы подключить отверстие и предотвратить муху от побега во время эксперимента, в то же время позволяя поток воздуха в трубку. Кроме того, пластиковые колпачки с небольшими отверстиями (Trikinetics, Inc.) могут быть использованы для закрытия отверстия.
5. Убедитесь, что трубки укладываются по бокам до пробуждения мухи, иначе есть риск того, что муха застрянет в пище.
6. Вставьте трубки в мониторы активности. С более новой, более компактной моделью мониторов Trikinetics (Trikinetics DAM2 и DAM2-7), необходимо держать пробки на месте с резинками для того чтобы обеспечить что инфракрасный луч проходит пробку на положении центра.
7. Поместите мониторы активности в инкубаторы и подключите их к системе сбора данных через телефонные провода. Проверьте с помощью программного обеспечения сбора системы DAM, чтобы убедиться, что все мониторы подключены должным образом и данные собираются с каждого из них. Монитор излучает инфракрасный световой луч по центру каждой стеклянной трубки активности. Локомотивная активность мух регистрируется как необработанные бинарные данные, где "один" записывается каждый раз, когда инфракрасный луч нарушается или "ноль" записывается, в котором инфракрасный луч не нарушается.

2. Экспериментальный дизайн для записи данных для определения циркадной периодичности и амплитуды

1. Мухи синхронизируются и затренируются, подвергая их желаемому свету/темному (LD) и температурному режиму в течение 2-5 полных дней. Наиболее часто используемым условием обучения является светло-темный цикл 12 часов света / 12 часов темно (12:12 ЛД) при 25 градусов по Цельсию. Это общепринятое стандартное условие по существу основано на мысли, что Дрозофила возникла из афро-экваториальных мест. При изучении циркадных ритмов есть некоторая фразеология, с чем нужно ознакомиться. В соответствии с этим протоколом время, когда свет загорается в инкубаторе, определяется как время zeitgeber 0 (ЗТ0), а все остальные времена относительно этого значения (например, в цикле 12:12 LD, т.е. это время, когда свет выключен). В стандартных условиях 12:12 LD, дикий тип Drosophila melanogaster обычно проявляют два приступа деятельности; один из них сосредоточен вокруг ЦТ0, который называют «утренним» пиком, а другой вокруг ЗТ12 называют «вечерним» пиком(рисунок 1А). Утренние и вечерние приступы контролируются эндогенными часами, но есть также "стартовые" ответы, которые являются переходными всплесками активности в ответ на светлые/темные переходы. Два дня увлечение является минимальным и могут быть использованы, например, на больших экранах, которые являются более трудоемкими и направлены на измерение свободного бега периодов в постоянной темноте (см. ниже, шаг 2). Однако, если вы заинтересованы в изучении моделей активности во время ежедневного светло-темного цикла, предпочтительнее поддерживать мух в течение 4-5 дней в ЛД, чтобы получить больше данных. Существенное увеличение количества мух или количества дней LD в анализе окончательных данных (например, данные пула за последние два дня стоимости локомотивной активности LD) будет генерировать более надежные профили и измерения активности дивральной активности (например, время утреннего или вечернего пика). Кроме того, ежедневное распределение активности варьируется в зависимости от дневной длины (фотопериод) и температуры. Основной причиной для изменения фотопериод или температуры от стандарта, если кто-то хотел бы изучить, как повседневная активность модели проходят сезонную адаптацию (например, Чэнь и др., Холодная весна Харб Symp Квант Биол. (2007)). Дрозофила также может быть поглощена ежедневными температурными циклами (например, Глейзер и Станевский, Curr Biol. (2005); Сехадова и др., Нейрон (2009)). Температурных циклов, которые варьируются всего на 2-3 градусов по Цельсию, достаточно для вовлечения ритмов активности.
2. Свободные ритмы беговой локомотивной активности измеряются в постоянных темных и температурных условиях после завершения периода обучения (см. выше, шаг 1). Установка светового цикла может быть изменена в любое время в темной фазе в последний день LD так, что последующий день эксперимента представляет собой первый день DD. Семь дней сбора данных ПД достаточно для расчета циркадного периода и амплитуды (например, силы или силы ритма) мух. Как правило, размер выборки не менее 16 мух необходим для получения надежных периодов свободного бега для конкретного генотипа. Даже если кто-то заинтересован только в измерении суточной активности, все равно лучше всего измерять свободно работающие периоды мух в ПД, поскольку изменения в эндогенный период могут изменить ежедневное распределение активности в ЛД. Например, мухи с длительными эндогенными периодами обычно демонстрируют отложенные вечерние пики в LD (например, см. рисунок 2).
3. По завершении эксперимента необработанные бинарные данные, собранные с помощью программного обеспечения DAM System, загружаются на портативное устройство хранения данных, например, USB-ключ.
4. Необработанные бинарные данные обрабатываются с помощью DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) и суммируются в 15 и 30 минут бункеров при анализе циркадных параметров, или от 1 до 5 минут бункеров при анализе сна / отдыха параметров. В настоящее время пять смежных минут бездействия является стандартным определением сна/отдыха в Дрозофиле (Hendricks et al., Neuron (2000); Хо и Сегал, Методы Enzymol., (2005)).
5. Существует множество различных способов анализа данных, собранных в системе DAM, но мы предоставим только те методы, которые обычно используются в нашей лаборатории. Microsoft Excel используется для присвоения генотипа различным группам выборки. Программное обеспечение FaasX (M. Boudinot и F. Rouyer, Центр Национального де ла Recherche Scientifique, Гиф-сюр-Иветт Cedex, Франция) или Insomniac (Программа на основе Matlab; Лесли Эшмор, Университет Питтсбурга, штат Пенсильвания) используются для изучения циркадных (например, период и власть) или сна / отдыха (например, процент сна, средняя длина боя отдыха) параметры соответственно.

Representative Results

Рисунок 1: Графики eduction, генерируемые с помощью FaasX, показывающие ежедневные ритмы локомотивной активности ритмических диких мух типа (w на ⁰ мух, несущих трансген за единицу) (A и B) против аритмии w ^{на 0} мутантов (C и D). Мужские мухи держались на уровне 25 градусов по Цельсию и в течение 4 дней в 12:12 LD (свет: темные) циклы, а затем семь дней в DD (постоянная темнота). Для каждой линии мух уровни активности отдельных мух (n'gt;32) измерялись в 15-минутных бункерах, а затем усреднились для получения представителя профиля группы для этой строки. A и C показывают данные активности, полученные в результате усреднения второго и третьего дней в светло-темном цикле (LD 2-3), в то время как B и D показывают данные активности, генерируемые в среднем второй и третий дни в постоянной темноте (DD 2-3). Вертикальные бары представляют активность (в произвольных единицах), записанную в 15-минутных бункерах в световой период (светло-серый) или темный период (темно-серый). Горизонтальные бары в нижней части графиков LD eduction; белый, свет на; черный цвет, выключенный свет. Для графиков eduction DD; CT0 и CT12 представляют собой начало и конец субъективного дня в постоянных темных условиях, обозначаемых серым баром. В панели A, M и утренний пик; E и вечерний пик. Стрелки в панели А представляют собой ожидаемое поведение утренних и вечерних пиков, наблюдаемых у диких мух типа, ^{которые отсутствуют в w на 0} аритмик мух. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Двухвековая актограмма, созданная с помощью программного обеспечения FaasX, иллюстрирующего данные о локомотивной активности мух с диким типом, коротким или длинным периодом. Мужские мухи держались на уровне 25 градусов по Цельсию и затрены в течение 4 дней в 12:12 LD циклов следуют восемь дней в постоянной темноте (DD) для расчета свободного периода (т) с помощью цикла-P в FaasX. Три линии мух с периодом дикого типа «w^{per 0;}per»; на^{0 мутантов,} несущих трансген, длительный период (w per^0;per(S47A); на^{0 мутантов,} несущих трансген (S47A), и короткий период (w per^0;per(S47D); на^{0 мутантов,} несущих per (S47D) трансген, показаны здесь (Chiu et al. 2008). X-ось представляет время ЗТ или КТ в LD или DD соответственно, а Y-axis представляет количество активности (произвольные единицы), суммированную в 15-минутные бункеры. Красные пунктирные линии соединяют вечерние пики для каждого дня экспериментов. Обратите внимание, что во время LD вечерний пик «вынужден» поддерживать синхронность с 24-часовым циклом LD, в то время как в ПД период свободного бега может отклоняться от 24 часов. Например, для мух с короткими периодами время вечерней активности будет происходить раньше в каждый последующий день в ДД (при построении против 24-часовой шкалы времени, как показано здесь), в то время как сдвиг вправо наблюдается для мух с длительными периодами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014