Drosophila Monitor de actividad (DAM): un método para medir la actividad locomotora en moscas

Overview

Este video describe el sistema de monitor de actividad Drosophila (DAM) utilizado para rastrear la actividad locomotora. Los investigadores utilizan datos de actividad recogidos de la DAM para estudiar ritmos circadianos en moscas de la fruta. El clip de protocolo destacado muestra cómo cargar moscas en el dispositivo y registrar datos de actividad para experimentos circadianos.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Chiu et al., Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp. (2010).

1. Carga de moscas en tubos de actividad y sistema de monitoreo de actividad locomotora

1. Antes de cargar moscas en tubos de actividad, encienda las incubadoras que se utilizarán para albergar los monitores de actividad. Ajuste la temperatura utilizando los controles de incubadora y ajuste el régimen de luz/oscuridad utilizando el controlador de luz dam system o el propio sistema de control de luz de las incubadoras de acuerdo con el diseño experimental deseado. El tiempo necesario para cargar moscas en tubos de actividad debe ser suficiente para que la temperatura se estabilice.
2. Anestesia las moscas con dióxido de carbono.
3. Utilice un pincel fino para transferir suavemente una sola mosca a un tubo de actividad.
4. Coge el centro de una sola pieza de hilo que es alrededor de media pulgada con fórceps finos e inserta el hilo en el extremo no alimentario del tubo de actividad para tapar la abertura y evitar que la mosca escape durante el experimento, al mismo tiempo que permite el flujo de aire en el tubo. Alternativamente, las tapas de plástico con agujeros pequeños (Trikinetics, Inc.) se pueden utilizar para cerrar la abertura.
5. Asegúrese de que los tubos estén colocados en sus lados hasta que la mosca despierte, o de lo contrario existe el riesgo de que la mosca se atasque a la comida.
6. Inserte los tubos en los monitores de actividad. Con el modelo más nuevo y compacto de los monitores Trikinetics (Trikinetics DAM2 y DAM2-7), es necesario mantener los tubos en su lugar con bandas de goma para garantizar que el haz infrarrojo pase el tubo en la posición central.
7. Coloque los monitores de actividad en las incubadoras y conénteses al sistema de recopilación de datos a través de los cables telefónicos. Compruebe el uso del software de recopilación dam system para asegurarse de que todos los monitores están conectados correctamente y los datos se están recopilando de cada uno de ellos. El monitor emite haz de luz infrarroja a través del centro de cada tubo de actividad de vidrio. La actividad locomotora de las moscas se registra como datos binarios crudos donde se registra "uno" cada vez que se rompe el haz infrarrojo o se registra un 'cero' en el que el haz infrarrojo no se rompe.

2. Diseño experimental para registrar datos para la determinación de la periodicidad y amplitud circadianas

1. Las moscas se sincronizan y se entreentren exponiéndolas a la luz/oscuridad deseada (LD) y al régimen de temperatura durante 2-5 días completos. La condición de enentrenamiento más utilizada es un ciclo claro/oscuro de 12 horas de luz/ 12 horas de oscuridad (12:12 LD) a 25 °C. Esta condición estándar generalmente aceptada se basa esencialmente en la idea de que Drosophila se originó en lugares afro-ecuatoriales. Al estudiar ritmos circadianos hay alguna fraseología con la que uno necesita familiarizarse. Relevante para este protocolo, el momento en que las luces se encienden en la incubadora se define como zeitgeber time 0 (ZT0) y todas las demás veces son relativas a ese valor (por ejemplo, en un ciclo LD 12:12, ZT12 es el momento en que las luces están apagadas). Bajo las condiciones estándar de 12:12 LD, el tipo salvaje Drosophila melanogaster típicamente exhibe dos episodios de actividad; uno centrado alrededor de ZT0 llamado pico "mañana" y otro alrededor de ZT12 llamado pico "por la noche" (Figura 1A). Los combates de la mañana y la noche están controlados por el reloj endógeno, pero también hay respuestas "sorprendentes" que son ráfagas transitorias de actividad en respuesta a las transiciones claras/oscuras. Dos días de entrenamiento es el mínimo y podrían ser utilizados, por ejemplo, en pantallas grandes que consumen más tiempo y están orientadas a medir los períodos de funcionamiento libre en constante oscuridad (ver abajo, paso 2). Sin embargo, si usted está interesado en estudiar los patrones de actividad durante un ciclo diario de luz-oscuridad, es preferible mantener las moscas durante 4-5 días en LD con el fin de obtener más datos. Esencialmente, aumentar el número de moscas o el número de días de LD en el análisis final de datos (por ejemplo, datos de piscina de los últimos dos días de actividad locomotora LD) generará perfiles y mediciones de actividad diurna más fiables (por ejemplo, el momento del pico de la mañana o la noche). Además, la distribución diaria de la actividad varía en función de la duración del día (fotoperiodo) y la temperatura. Una de las principales razones para alterar el fotoperiodo o la temperatura de la norma es si se quería estudiar cómo los patrones de actividad diaria se someten a adaptación estacional (por ejemplo, Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). Drosophila también se puede encerrar a ciclos de temperatura diarios (por ejemplo, Glaser y Stanewsky, Curr Biol. (2005); Neuron (2009)). Los ciclos de temperatura que varían solo entre 2 y 3 °C son suficientes para restringir los ritmos de actividad.
2. Los ritmos de actividad locomotora de funcionamiento libre se miden en condiciones constantes de oscuridad y temperatura una vez finalizado el período de entrenamiento (ver arriba, paso 1). El ajuste para el ciclo de luz se puede cambiar en cualquier momento en la fase oscura en el último día de LD de tal manera que el día posterior del experimento representa el primer día de DD. Siete días de recolección de datos DD es suficiente para calcular el período circadiano y la amplitud (por ejemplo, potencia o fuerza de ritmo) de las moscas. En general, un tamaño de muestra de al menos 16 moscas es necesario para obtener períodos de funcionamiento libre fiables para un genotipo determinado. Incluso si uno sólo está interesado en medir la actividad diurna, todavía es mejor medir los períodos de funcionamiento libre de las moscas en DD, ya que los cambios en el período endógeno pueden alterar la distribución diaria de la actividad en LD. Por ejemplo, las moscas con largos períodos endógenos suelen presentar picos nocturnos retrasados en LD (por ejemplo, véase la Figura 2).
3. Al final del experimento, los datos binarios sin procesar recopilados con el software DAM System se descargan en un dispositivo de almacenamiento de datos portátil, por ejemplo, la clave USB.
4. Los datos binarios sin procesar se procesan utilizando DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) y se suman en ubicaciones de 15 y 30 minutos al analizar parámetros circadianos, o ubicaciones de 1 a 5 minutos al analizar parámetros de suspensión/reposo. Actualmente, cinco minutos contiguos de inactividad es la definición estándar de sueño/descanso en Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho y Sehgal, Métodos Enzymol., (2005)).
5. Hay muchas maneras diferentes de analizar los datos recogidos en el Sistema DAM, pero solo proporcionaremos esos métodos utilizados rutinariamente en nuestro laboratorio. Microsoft Excel se utiliza para asignar genotipo a diferentes grupos de ejemplo. Software FaasX (M. Boudinot y F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Francia) o Insomniac (programa basado en Matlab; Leslie Ashmore, Universidad de Pittsburgh, PA) se utilizan para examinar los parámetros circadianos (por ejemplo, período y potencia) o sueño/descanso (por ejemplo, sueño porcentual, duración media de la pelea de descanso), respectivamente.

Representative Results

Figura 1: Gráficos de educción generados con FaasX que muestran ritmos diarios de actividad locomotora de moscas rítmicas de tipo salvaje (w por^{cada 0} moscas que transportan un transgénero per+) (A y B) frente a los arritmias w por⁰ mutantes (C y D). Las moscas macho se mantuvieron a 25 °C y se entrenaron durante 4 días en ciclos de 12:12 LD (claro: oscuro) seguidos de siete días en DD (oscuridad constante). Para cada línea de vuelo, los niveles de actividad locomotora de moscas individuales (n>32) se midieron en contenedores de 15 minutos y luego promediaron para obtener un representante de perfil de grupo para esa línea. A y C muestran los datos de actividad generados por promediar el segundo y tercer día en ciclo claro/oscuro (LD 2-3), mientras que B y D muestran los datos de actividad generados por promediar el segundo y tercer día en oscuridad constante (DD 2-3). Las barras verticales representan la actividad (en unidades arbitrarias) registrada en contenedores de 15 minutos durante el período de luz (gris claro) o el período oscuro (gris oscuro). Barras horizontales en la parte inferior de los gráficos de educción LD; blanco, luces encendidas; negro, luces apagadas. Para gráficos de educción DD; Ct0 y CT12 representan el inicio y el final del día subjetivo en condiciones oscuras constantes, denotadas por la barra gris. En el panel A, M = pico matutino; E = pico de la tarde. Las flechas en el panel A representan el comportamiento anticipado de los picos matutinos y nocturnos observados en moscas de tipo salvaje, que están ausentes en w por^{cada 0} moscas arritmicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Actograma de doble trazado generado utilizando el software FaasX que ilustra datos de actividad locomotora de moscas con tipo salvaje, corto o largo período. Las moscas macho se mantuvieron a 25 °C y se entrenaron durante 4 días en ciclos LD 12:12 seguidos de ocho días en oscuridad constante (DD) para el cálculo del período de ejecución libre (t) utilizando el Ciclo-P en FaasX. Tres líneas de vuelo con período de tipo salvaje [w por^0;per+; por^{cada 0} mutante que transporta por+ transgénero], período largo [w por^0;por(S47A); por⁰ por transporte mutante por (S47A) transgénero], y período corto [p por^0;por(S47D); por⁰ por transporte mutante por (S47D) transgénero] se muestran aquí (Chiu et al. 2008). X-axis representa el tiempo ZT o CT en LD o DD respectivamente, y el eje Y representa recuentos de actividad (unidades arbitrarias) resumidos en ubicaciones de 15 minutos. Las líneas de puntos rojos conectan los picos nocturnos para cada día de los experimentos. Tenga en cuenta que durante el LD el pico de la noche se 'obliga' a mantener la sincronía con el ciclo LD de 24 horas, mientras que en DD el período de funcionamiento libre puede desviarse a partir de las 24 horas. Por ejemplo, para las moscas con períodos cortos, el tiempo de la actividad nocturna se producirá más temprano en cada día sucesivo en DD (cuando se traza contra una escala de tiempo de 24 horas, como se muestra aquí), mientras que se observa un cambio a la derecha para las moscas con períodos largos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014