Drosophila (olika betydelser) Aktivitetsövervakare (DAM): En metod för att mäta lokomotorisk aktivitet i flugor

Overview

Den här videon beskriver Drosophila aktivitetsövervakare (DAM) system som används för att spåra lokomotorisk aktivitet. Forskare använder aktivitetsdata som samlats in från DAM för att studera dygnsrytm i fruktflugor. Det presenterade protokollklippet visar hur du laddar flugor i enheten och registrerar aktivitetsdata för dygnsrytmexperiment.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Chiu et al., Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp. (2010).

1. Lastning av flugor i aktivitetsrör och lokomotoriskt aktivitetsövervakningssystem

1. Innan du laddar flugor i aktivitetsrör, slå på inkubatorerna som kommer att användas för att hysa aktivitetsmonitorerna. Justera temperaturen med inkubatorreglagen och ställ in den ljusa/mörka regimen med hjälp av DAM System ljusregulator eller inkubatorerna eget ljusstyrningssystem enligt önskad experimentell design. Den tid som krävs för att ladda flugor i aktivitetsrör bör vara tillräcklig för att temperaturen ska stabiliseras.
2. Söv flugorna med koldioxid.
3. Använd en fin pensel för att försiktigt överföra en enda fluga till ett aktivitetsrör.
4. Ta tag i mitten av en enda garnbit som är cirka en halv tum med fina tångar och sätt in garnet i aktivitetsrörets icke-matslut för att ansluta öppningen och förhindra att flugan läcker ut under experimentet, samtidigt som luftflödet tillåts in i röret. Alternativt kan plastlock med små hål (Trikinetics, Inc.) användas för att stänga öppningen.
5. Se till att rören läggs på sidorna tills flugan vaknar, annars finns det risk för att flugan fastnar på maten.
6. Sätt in rören i aktivitetsmonitorerna. Med den nyare, mer kompakta modellen av Trikinetics-skärmarna (Trikinetics DAM2 och DAM2-7) är det nödvändigt att hålla rören på plats med gummiband för att säkerställa att den infraröda strålen passerar röret i mittläget.
7. Sätt aktivitetsmonitorerna i inkubatorerna och anslut dem till datainsamlingssystemet via telefonledningarna. Kontrollera med hjälp av DAM System insamling programvara för att se till att alla bildskärmar är anslutna korrekt och data samlas in från var och en av dem. Monitorn avger infraröd ljusstråle över mitten av varje glasaktivitetsrör. Flugornas lokomotoriska aktivitet registreras som rå binära data där "en" registreras varje gång den infraröda strålen bryts eller en "nolla" registreras där den infraröda strålen inte bryts.

2. Experimentell design för att registrera data för bestämning av dygnsrytm periodicitet och amplitud

1. Flugor synkroniseras och tränas genom att utsätta dem för önskat ljus / mörker (LD) och temperaturregimen i 2-5 hela dagar. Det vanligaste inskolningsförhållandet är en ljus/mörk cykel på 12 timmar ljus/ 12 timmar mörk (12:12 LD) vid 25 °C. Detta allmänt accepterade standardvillkor är i huvudsak baserat på tanken att Drosophila härstammar från afro-ekvatorialplatser. När man studerar dygnsrytmer finns det någon frasologi som man måste bekanta sig med. Relevant för detta protokoll definieras den tid då lamporna tänds i inkubatorn som zeitgebertid 0 (ZT0) och alla andra gånger är i förhållande till det värdet (t.ex. i en 12:12 LD-cykel är ZT12 den tidpunkt då lamporna släcks). Under standard 12:12 LD-förhållanden uppvisar den vilda typen Drosophila melanogaster vanligtvis två anfall av aktivitet; en centrerade runt ZT0 kallas "morgon" topp och en annan runt ZT12 kallas "kväll" topp (Figur 1A). Morgon- och kvällsmatcherna styrs av den endogena klockan men det finns också "häpnadsväckande" svar som är övergående utbrott av aktivitet som svar på de ljusa / mörka övergångarna. Två dagars utbildning är minimum och kan användas till exempel i stora skärmar som är mer tidskrävande och är inriktade på att mäta fri körperioder i konstant mörker (se nedan, steg 2). Men om du är intresserad av att studera aktivitetsmönstren under en daglig ljus-mörk cykel är det att föredra att behålla flugorna i 4-5 dagar i LD för att få mer data. I huvudsak kommer en ökning av antalet flugor eller antalet LD-dagar i den slutliga dataanalysen (t.ex. pooldata från de senaste två dagarna av LD-lokomotorisk aktivitet) att generera mer tillförlitliga dagliga aktivitetsprofiler och mätningar (t.ex. tidpunkt för morgon- eller kvällstopp). Dessutom varierar den dagliga fördelningen av aktivitet som en funktion av dagslängd (fotoperiod) och temperatur. En viktig anledning till att ändra fotoperioden eller temperaturen från standarden är om man ville studera hur dagliga aktivitetsmönster genomgår säsongsanpassning (t.ex. Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). Drosophila kan också tränas till dagliga temperaturcykler (t.ex. Glaser och Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova o.a., Neuron (2009)). Temperaturcykler som varierar med endast 2-3 °C är tillräckliga för att träna aktivitetsrytmer.
2. Fri löplokomotorisk aktivitetsrytm mäts under konstant mörker och temperaturförhållanden efter att inskolningsperioden är avslutad (se ovan, steg 1). Inställningen för ljuscykeln kan ändras när som helst i den mörka fasen på den sista dagen av LD så att den efterföljande dagen av experimentet representerar den första dagen av DD. Sju dagar av DD-datainsamling är tillräckligt för att beräkna dygnsrytmperioden och amplituden (t.ex. kraft eller rytmstyrka) hos flugor. I allmänhet är en provstorlek på minst 16 flugor nödvändig för att erhålla tillförlitliga fri körperioder för en viss genotyp. Även om man bara är intresserad av att mäta daglig aktivitet är det fortfarande bäst att mäta flugornas friperioder i DD eftersom förändringar i endogen period kan förändra den dagliga fördelningen av aktivitet i LD. Flugor med långa endogena perioder uppvisar till exempel vanligtvis fördröjda kvällstoppar i LD (t.ex. se figur 2).
3. I slutet av experimentet laddas rå binära data som samlas in med hjälp av DAM System-programvaran ner till en bärbar datalagringsenhet, t.ex. USB-nyckel.
4. De råa binära data bearbetas med DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) och summeras till 15 och 30 minuters lagerplatser när du analyserar dygnsrytmparametrar, eller 1 till 5 minuters lagerplatser när du analyserar sömn-/viloparametrar. För närvarande är fem sammanhängande minuter av inaktivitet standarddefinitionen av sömn / vila i Drosophila (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho och Sehgal, Metoder Enzymol., (2005)).
5. Det finns många olika sätt att analysera de data som samlas in på DAM-systemet, men vi kommer bara att tillhandahålla de metoder som rutinmässigt används i vårt labb. Microsoft Excel används för att tilldela genotyp till olika exempelgrupper. FaasX programvara (M. Boudinot och F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Frankrike) eller Insomniac (Matlab-baserat program; Leslie Ashmore, University of Pittsburgh, PA) används för att undersöka dygnsrytm (t.ex. period och kraft) eller sömn/vila (t.ex. procentuell sömn, genomsnittlig vilolängd) parametrar respektive.

Representative Results

Figur 1: Uppduktionsgrafer som genereras med FaasX och som visar dagliga lokomotoriska aktivitetsrytmer av rytmiska vilda flugor (w per^{0 flugor} som bär per+ transgen) (A och B) jämfört med arytmiska w per⁰ mutanter (C och D). Manliga flugor hölls vid 25 °C och tränades i 4 dagar i 12:12 LD (ljus: mörk) cykler följt av sju dagar i DD (konstant mörker). För varje flyglinje mättes de lokomotoriska aktivitetsnivåerna för enskilda flugor (n>32) i 15-minutersfack och var sedan genomsnittliga för att erhålla en gruppprofilrepresentant för den linjen. A och C visar aktivitetsdata som genererats från medelvärdet för andra och tredje dagen i ljus/mörk cykel (LD 2-3) medan B och D visar aktivitetsdata som genererats från i genomsnitt andra och tredje dagen i konstant mörker (DD 2-3). Vertikala staplar representerar aktiviteten (i godtyckliga enheter) som registrerats i 15-minutersfack under ljusperioden (ljusgrå) eller den mörka perioden (mörkgrå). Horisontella staplar längst ned i LD-upprullningsgrafer. vit, lamporna tända; ZT0 och ZT12 representerar fotoperiodens början respektive. För DD-uppduktionsgrafer; CT0 och CT12 representerar början och slutet av den subjektiva dagen i konstanta mörka förhållanden, betecknade av den grå stapeln. I panel A, M = morgontopp; E = kvällstopp. Pilarna i panel A representerar föregripande beteende hos morgon- och kvällstoppar som observerats i vilda flugor, som är frånvarande i w per⁰ arytmiska flugor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Dubbel plot-aktogram som genereras med FaasX-programvaran som illustrerar lokomotoriska aktivitetsdata för flugor med vild typ, kort eller lång period. Manliga flugor hölls vid 25 °C och tränades i 4 dagar i 12:12 LD-cykler följt av åtta dagar i konstant mörker (DD) för beräkning av fri körperioden (t) med Cycle-P i FaasX. Tre flyglinjer med vild typperiod [w per⁰; per+; Per⁰ mutant som transporterar per+ transgen], lång period [w per⁰; per(S47A). Per⁰ mutant som transporterar transgen (S47A) och kort period [w per^0,per(S47D). per⁰ mutant carrying per(S47D) transgene] visas här (Chiu et al. 2008). X-axeln representerar ZT- eller CT-tid i LD respektive DD, och Y-axeln representerar aktivitetsantal (godtyckliga enheter) summerat till 15-minuters lagerplatser. De röda prickade linjerna förbinder kvällstopparna för varje dag av experimenten. Observera att under LD är kvällstoppen "tvingad" att upprätthålla synkron med 24-timmars LD-cykeln, medan i DD kan fri körperioden avvika från 24 timmar. Till exempel, för flugor med korta perioder kommer tidpunkten för kvällsaktiviteten att ske tidigare på varje på varandra följande dag i DD (när den plottas mot en 24 timmars tidsskala, som visas här), medan en förskjutning till höger observeras för flugor med långa perioder. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014