Drosophila Aktivite Monitörü (DAM): Sineklerde Lokomotor Aktivitesini Ölçme Yöntemi

Overview

Bu videoda, lokomotor aktivitesini izlemek için kullanılan Drosophila etkinlik monitörü (DAM) sistemi açıklanmaktadır. Araştırmacılar, meyve sineklerindeki sirkadiyen ritimleri incelemek için DAM'dan toplanan aktivite verilerini kullanırlar. Öne çıkan protokol klibi, cihaza sineklerin nasıl yüklendiğini ve sirkadiyen deneyler için etkinlik verilerinin nasıl kaydedildiğini gösterir.

Protocol

Bu protokol, Drosophila,J. Vis. Exp.'de (2010) Sirkadiyen Ritimleri ve Uyku Parametrelerini Incelemek için Locomotor Aktivitesini Test Etmek için Chiu ve ark.'danbir alıntıdır. 

1. Sineklerin Aktivite Tüplerine ve Lokomotor Aktivite İzleme Sistemine Yüklenmesi

1. Sinekleri aktivite tüplerine yüklemeden önce, aktivite monitörlerini barındırmak için kullanılacak inkübatörleri açın. İnkübatör kontrollerini kullanarak sıcaklığı ayarlayın ve DAM Sistemi ışık kontrol cihazını veya inkübatörleri kullanarak ışık/karanlık rejimi istenen deneysel tasarıma göre kendi ışık kontrol sistemini ayarlayın. Sinekleri aktivite tüplerine yüklemek için gereken süre, sıcaklığın stabilize olması için yeterli olmalıdır.
2. Sinekleri karbondioksitle uyuşturun.
3. Tek bir sineği bir aktivite tüpüne hafifçe aktarmak için ince bir boya fırçası kullanın.
4. İnce tokmaklarla yaklaşık yarım inç olan tek bir iplik parçasının ortasını tutun ve ipliği aktivite tüpünün gıda dışı ucuna takarak açıklığı tıkayın ve deney sırasında sineğin kaçmasını önleyin, aynı zamanda tüpe hava akışına izin verin. Alternatif olarak, açıklığı kapatmak için küçük delikli plastik kapaklar (Trikinetics, Inc.) kullanılabilir.
5. Sinek uyanana kadar tüplerin yanlarına yerleştirildiğından emin olun, aksi takdirde sinek yiyeceğe yapışmış olma riski vardır.
6. Tüpleri aktivite monitörlerine yerleştirin. Trikinetics monitörlerin (Trikinetics DAM2 ve DAM2-7) daha yeni, daha kompakt modeli ile, kızılötesi ışının tüpü merkez konumda geçtiğinden emin olmak için tüpleri lastik bantlarla yerinde tutmak gerekir.
7. Etkinlik monitörlerini kuvözlere takın ve telefon kabloları aracılığıyla veri toplama sistemine bağlayın. Tüm monitörlerin düzgün bağlandığından ve her birinden veri toplandığından emin olmak için DAM Sistem toplama yazılımını kullanmayı kontrol edin. Monitör, her cam aktivite tüpünün ortasına kızılötesi ışık ışını yayar. Sineklerin lokomotor aktivitesi, kızılötesi ışın her kırılışında "bir" kaydedildiği veya kızılötesi ışının kırılmadığı bir 'sıfır' kaydedildiği ham ikili veri olarak kaydedilir.

2. Sirkadiyen Periyodiklik ve Genliğin Belirlenmesi için Verileri Kaydetmek için Deneysel Tasarım

1. Sinekler senkronize edilir ve 2-5 tam gün boyunca istenen ışık /karanlık (LD) ve sıcaklık rejimine maruz bırakarak eğitilir. En sık kullanılan eğitim durumu, 25 °C'de 12 saat açık/ 12 saat karanlık (12:12 LD) bir ışık/karanlık döngüsüdür. Genel olarak kabul edilen bu standart durum esasen Drosophila'nın Afro-ekvatoral konumlardan kaynaklandığı düşüncesine dayanmaktadır. Sirkadiyen ritimleri incelerken, aşina olunması gereken bazı ifadeolojileri vardır. Bu protokolle ilgili olarak, inkübatörde ışıkların yandığı zaman zeitgeber süresi 0 (ZT0) olarak tanımlanır ve diğer tüm zamanlar bu değere göredir (örneğin, 12:12 LD döngüsünde, ZT12 ışıkların kapalı olduğu zamandır). Standart 12:12 LD koşulları altında, vahşi tip Drosophila melanogaster tipik olarak iki aktivite nöbeti sergiler; biri ZT0 etrafında ortalanmış "sabah" zirvesi ve diğeri ZT12 etrafında "akşam" zirvesi olarak adlandırılan (Şekil 1A). Sabah ve akşam nöbetleri endojen saat tarafından kontrol edilir, ancak açık / karanlık geçişlere yanıt olarak geçici aktivite patlamaları olan "ürkünme" yanıtları da vardır. İki günlük eğitim minimumdur ve örneğin, daha fazla zaman alan ve sürekli karanlıkta serbest çalışan süreleri ölçmeye yönelik büyük ekranlarda kullanılabilir (aşağıya bakın, adım 2). Bununla birlikte, günlük açık-karanlık bir döngü sırasında aktivite kalıplarını incelemekle ilgileniyorsanız, daha fazla veri elde etmek için sinekleri LD'de 4-5 gün tutmak tercih edilir. Temel olarak, nihai veri analizinde sinek sayısını veya LD gün sayısını artırmak (örneğin, son iki günlük LD lokomotor aktivitesinin havuz verileri) daha güvenilir günlük aktivite profilleri ve ölçümleri (örneğin, sabah veya akşam zirvesinin zamanlaması) üretecektir. Ayrıca, günlük aktivite dağılımı gün boyu (fotoperiyod) ve sıcaklığın bir işlevi olarak değişir. Fotoperiyodu veya sıcaklığı standarttan değiştirmenin önemli bir nedeni, günlük aktivite kalıplarının mevsimsel adaptasyondan nasıl geçtiğini incelemek istemesidir (örneğin Chen ve ark., Soğuk Bahar Harb Symp Quant Biol. (2007)). Drosophila günlük sıcaklık döngülerine de hapsedilebilir (örneğin Glaser ve Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova vd., Nöron (2009)). Sadece 2-3 °C değişen sıcaklık döngüleri aktivite ritimlerini eğitmek için yeterlidir.
2. Serbest çalışan lokomotor aktivite ritimleri, entraining süresi bittikten sonra sabit karanlık ve sıcaklık koşulları altında ölçülür (yukarıya bakın, adım 1). Işık döngüsünün ayarı, LD'nin son gününde karanlık fazda herhangi bir zamanda değiştirilebilir, böylece deneyin sonraki günü DD'nin ilk gününü temsil eder. Yedi günlük DD veri toplama, sineklerin sirkadiyen dönemini ve genliğini (örneğin, ritmin gücü veya gücü) hesaplamak için yeterlidir. Genel olarak, belirli bir genotip için güvenilir serbest çalışma süreleri elde etmek için en az 16 sineklik bir örnek boyutu gereklidir. Kişi sadece günlük aktiviteyi ölçmekle ilgilense bile, uçojen dönemdeki değişiklikler LD'deki günlük aktivite dağılımını değiştirebileceğinden, sineklerin serbest çalışma sürelerini DD'de ölçmek hala en iyisidir. Örneğin, uzun endojen dönemlere sahip sinekler genellikle LD'de gecikmiş akşam zirveleri sergiler (örneğin, bkz. Şekil 2).
3. Denemenin sonunda, DAM Sistemi yazılımı kullanılarak toplanan ham ikili veriler, USB anahtarı gibi taşınabilir bir veri depolama cihazına indirilir.
4. Ham ikili veriler DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) kullanılarak işlenir ve sirkadiyen parametreleri analiz ederken 15 ve 30 dakikalık depo gözleri veya uyku/dinlenme parametrelerini analiz ederken 1 ila 5 dakikalık depo gözleri halinde toplanır. Şu anda, beş bitişik dakika hareketsizlik Drosophila'da uyku / dinlenmenin standart tanımıdır (Hendricks ve ark., Neuron (2000); Ho ve Sehgal, Yöntemler Enzymol., (2005)).
5. DAM Sistemi'nde toplanan verileri analiz etmenin birçok farklı yolu vardır, ancak sadece laboratuvarımızda rutin olarak kullanılan bu yöntemleri sağlayacağız. Microsoft Excel, farklı örnek gruplara genotip atamak için kullanılır. FaasX yazılımı (M. Boudinot ve F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, Fransa) veya Insomniac (Matlab tabanlı program; Leslie Ashmore, Pittsburgh Üniversitesi, PA) sirkadiyen (örneğin dönem ve güç) veya uyku /dinlenme (örneğin yüzde uyku, ortalama dinlenme bout uzunluğu) parametrelerini incelemek için kullanılır.

Representative Results

Şekil 1: Ritmik vahşi tip sineklerin günlük lokomotor aktivite ritimlerini gösteren FaasX kullanılarak oluşturulan baştan çıkarma grafikleri (her bir transgene taşıyan ⁰ sinek başına w) (A ve B) ve ⁰ mutant başına aritmik w (C ve D). Erkek sinekler 25 ° C'de tutuldu ve 12:12 LD (açık: karanlık) döngülerinde 4 gün boyunca eğitildi ve ardından DD'de yedi gün (sabit karanlık). Her sinek hattı için, bireysel sineklerin (n>32) lokomotor aktivite seviyeleri 15 dakikalık depo gözleri ile ölçüldü ve daha sonra bu hat için bir grup profili temsilcisi elde etmek için ortalama alındı. A ve C, açık/karanlık döngüde (LD 2-3) ikinci ve üçüncü günlerin ortalamasından oluşturulan etkinlik verilerini gösterirken, B ve D sabit karanlıkta ikinci ve üçüncü günlerin ortalamasından oluşturulan etkinlik verilerini gösterir (DD 2-3). Dikey çubuklar, açık dönem (açık gri) veya koyu dönem (koyu gri) sırasında 15 dakikalık depo gözleri halinde kaydedilen etkinliği (rasgele birimlerde) temsil eder. LD eğitim grafiklerinin altındaki yatay çubuklar; beyaz, ışıklar açık; siyah, ışıklar kapalı. ZT0 ve ZT12 sırasıyla fotoperiyod başlangıcını ve sonunu temsil eder. DD eğitim grafikleri için; CT0 ve CT12, gri çubukla belirtilen sabit karanlık koşullarda öznel günün başlangıcını ve sonunu temsil eder. Panelde A, M = sabah zirvesi; E = akşam zirvesi. Panel A'daki oklar, ⁰ aritmik sinek başına w'da bulunmayan vahşi tip sineklerde gözlenen sabah ve akşam zirvelerinin beklenti davranışını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Vahşi tip, kısa veya uzun süreli sineklerin lokomotor aktivite verilerini gösteren FaasX yazılımı kullanılarak oluşturulan çift çizimli actogram. Erkek sinekler 25 ° C'de tutuldu ve 12:12 LD döngülerinde 4 gün boyunca eğitildi ve ardından FaasX'te Cycle-P kullanılarak serbest çalışma süresinin (t) hesaplanması için sekiz gün boyunca sabit karanlıkta (DD) eğitildi. Vahşi tip periyodu olan üç uçucu hat [w başına⁰; per+; + transgene başına taşıyan ⁰ mutant başına], uzun süre ^[0başınaw ; per(S47A); (S47A) transgene başına ⁰ mutant taşıma başına] ve kısa süre [w başına⁰; per(S47D); her⁰ mutant taşıma başına (S47D) transgene] burada gösterilmiştir (Chiu ve ark. 2008). X ekseni sırasıyla LD veya DD cinsinden ZT veya CT zamanını temsil eder ve Y ekseni 15 dakikalık depo gözlerine toplanmış etkinlik sayılarını (rasgele birimler) temsil eder. Kırmızı noktalı çizgiler, deneylerin her günü için akşam zirvelerini birbirine bağlar. LD sırasında akşam zirvesinin 24 saatlik LD döngüsüyle senkronizasyonu korumak için 'zorlandığını', DD'de serbest çalışma süresinin ise 24 saatten sapabileceğini unutmayın. Örneğin, kısa süreli sinekler için akşam aktivitesinin zamanlaması DD'deki her ardışık günde daha erken gerçekleşecektir (burada gösterildiği gibi 24 saat zaman ölçeğine göre çizildiğinde), uzun süreli sinekler için sağa doğru bir kayma gözlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	DAM2 or DAM5	DAM2 monitors are more compact, and more can fit into a single incubator
Power supply interface unit (for DAM system)	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PSIU9	Includes PS9-1 AC Power Supply
Light controller	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	LC6
Pyrex glass tubes	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	PGT5, PGT7, and PGT10
Plastic activity tube caps	Trikinetics Inc.; Waltham, MA	CAP5	Yarn can be used instead of plastic caps.
DAM System data collection software	Trikinetics Inc.; Waltham, MA		Versions available for both Mac and PC
FaasX software	Centre National de la Recherche Scientifique		Only for Mac
Insomniac 2.0 software	University of Pittsburgh School of Medicine		Runs on Matlab. Can be used on both PC and Macintosh.
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. Percival incubator	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	Interior space dimension:Width: 65cm;Height: 86cm;Depth: 55cm
Environmental incubator with temperature and diurnal control, e.g. DigiTherm Heating/Cooling Incubator with Circadian Timed Lighting and Timed Temperature	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	Interior space dimension:Width: 36m;Height: 56m;Depth: 28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V (Emergency power backup unit)	APC	SU2200NET	Output Power Capacity of 1600 Watts
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Bacto Agar	BD Biosciences	214010
TissuePrep Paraffin pellets	Fisher Scientific	T565	Melting point 56 °C-57 °C
Block heater	VWR international	12621-014