דרוזופילה (לא כולל) אופטוגנטיקה: שיטה לתפעל מעגלים עצביים

Overview

אופטוגנטיקה מאפשרת שימוש באור כדי לתפעל נוירונים מהונדסים גנטית כדי לבטא חלבונים רגישים לאור-opsins ספציפיים שהפעלת האור שלהם גורמת לשינוי במצב הנוירון. כאן אנו מתארים גישה אופטוגנטית בדרוזופילה באמצעות opsin Channelrhodopsin2. פרוטוקול הדוגמה כולל מבחני אופטוגנטיקה שנקבעו כדי לחקור את המעגלים העצביים שמאחורי התנהגות הבריחה של הזבוב.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך דה פריס ו קלנדינין, גירוי אופטוגנטי של התנהגות בריחה ב Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2013).

1. צור זבובים Channelrhodopsin

1. קרוס UAS-ChR2 טס עם הנהג Gal4 על פי בחירתך, אנו משתמשים G105-Gal4, אשר בא לידי ביטוי נוירונים פומה-1 באונה האופטית.
2. כדי למנוע את האפשרות של תגובה חזותית לגירוי האור הכחול, שני קווי הזבוב נמצאים ברקע w⁺norpA.
3. תוצאת סיום: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. לאחר זבובים בוגרים eclose, לשים נקבות נבחרות על מזון טרי, בתוספת 10 μM כל טרנס-רשתית (גורם משותף נדרש ChR2) ומוגן מפני אור, במשך 3 ימים לפני ביצוע בדיקה התנהגותית.

2. הפוך 10 μM כל טרנס-רשתית מזון משופר

1. ממיסים 100 מ"ג של כל הרשתית הטרנס-רשתית ב 17.6 מ"ל של 95% אתנול כדי להפוך 20 mM רשתית. שמור על כל הרשתית מפני אור בכל עת.
2. ממיסים מזון זבוב קמח תירס סטנדרטי במיקרוגל, ולתת מגניב עד חם לגעת.
3. מערבבים 50 μl של 20 מ"מ כל טרנס-רשתית לתוך בקבוקונים של 10 מ"ל של מזון זבוב.
4. תן בקבוקונים להתקרר ולשמור מוגן מפני אור.

3. ציוד

1. טיפים פיפט: סטנדרטי 1,000 טיפים צינור μl נחתכים ליד הקצה, יצירת קוטר נקבובית של ~ 2.25 מ"מ.
2. פלטפורמה (ראו איור 1).
   1. בסיס דלרין, 17 ס"מ X 25 ס"מ, נבנה עם חורים משורשרים בכל פינה כדי להתאים מחברי צינור קירור NPT בגודל 1/4 אינץ'.
   2. מחזיק אנכי, עשוי דלרין, מחובר למרכז הבסיס. הממדים הכוללים הם 25 מ"מ X 40 מ"מ X 65 מ"מ (רוחב X עומק X גובה). חריץ ברוחב 10 מ"מ אורך המחזיק, עם בורג אגודל בתחתית. פלטפורמה מחוברת לחלק העליון של המחזיק, 25 מ"מ X 40 מ"מ X 10 מ"מ, עם חור בקוטר 3.5 מ"מ מיושר עם החריץ במחזיק.
3. מערכי LED (ראו איור 1).
   1. ארבע זרועות של צינור קירור, ~ 18 ס"מ אורך, מודבקים לבסיס הפלטפורמה באמצעות מחבר צינור קירור. צינור קירור משמש רק כתמיכה מבנית ואינו משמש למטרות קירור.
   2. חריצים במרווחים נאותים נחתכים לחתיכת הקירור הסופית של כל זרוע כדי להדביק מפזר חום לקצה כל זרוע.
   3. שלושה כוכבים כחולים של רבל LED מותקנים על כל כיור חום באמצעות סרט דבק תרמי חתוך מראש. עדשה משולשת של Carclo 18° מודבקת לכל שלושה כוכבים.
   4. כוכבי LED מחווטים לנהגי BuckPuck DC ואספקת חשמל כפי שצוין. ארגנו את ההקמת שלנו כשכל באק-פאק מפעיל שני שלושה כוכבים בסדרה.
   5. תאורה של כל ארבעת כוכבי LED ב 700 mA הניב הקרנה של 713 W / m² על הפלטפורמה שלנו.
4. מצלמה: המצלמה מותקנת על חצובה קטנה וממוקדת בחלק העליון של הפלטפורמה.

4. מבחנים התנהגותיים

1. הרדמה קצרה של זבובים על קרח.
2. מקם זבובים בודדים בעצות צנרת, באמצעות קלטת כדי לסגור את שני הקצוות של הקצה.
3. לאחר הזבובים התעוררו והם פעילים לחקור את קצה הצנרת, להסיר את הקלטת ומניחים צינור בחריץ במחזיק אנכי. אגודל משמש כדי לאבטח את קצה הצינור במקום ולסגור את החלק התחתון של הקצה.
4. כאשר הזבוב בוחן את קצה הצינור (בדרך כלל 30 - 60 שניות), התחל את הקלטת המצלמה רגע לפני שהטיסה מגיחה מהקצה אל הפלטפורמה.
5. לאחר הזבוב הגיח על הרציף, לחכות 1-2 שניות, ולהדליק את נוריות כחולות. השתמש בשעון העצר כדי למדוד באופן ידני את השעה עד שהטיסה תיזום טיסה.

Representative Results

איור 1: הגדרה ניסיונית המציגה את הפלטפורמה עם המחזיק האנכי וארבע זרועות הקירור המחזיקות כיורי חום עם מערכי LED מודבקים אליהם. (A)ההגדרה תחת תאורת הסביבה. (B)ההגדרה כאשר נוריות LED מוארות. (ג)מבט מקרוב על נורית תלת-כוכבים על מפזר החום. (D)תקריב של הטרי-סטאר עם שלוש העדשות מחוברות. (ה)סכמטי של נהג Buckpuck ומעגל LED. (F) דיאגרמת מעגלים עבור מעגל BuckPuck ו- LED. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20