ショウジョウバエ 光遺伝学:神経回路を操作する方法

Overview

光遺伝学は、光の活性化がニューロンの状態の変化を引き起こす特定のオプシン光感受性タンパク質を発現させるために遺伝子操作されたニューロンを操作するために光を使用することを可能にする。ここでは、オプシン・チャネロドプシン2を用いた ショウジョウバエ における光遺伝学的アプローチについて説明する。このプロトコルの例は、ハエのエスケープ行動の背後にある神経回路を研究するために設定された光遺伝学的アッセイを特徴としています。

Protocol

このプロトコルは、ド・フリースとクランディニン、ショウジョウバエメラノガスター 、J.ヴィスExp.(2013)における脱出行動の光遺伝学的刺激からの抜粋です。

1. チャネロドプシンハエを生成する

1. クロスUAS-ChR2は、お選びのGal4ドライバーと一緒に飛んで、我々は、光学ローブのFoma-1ニューロンで発現されているG105-Gal4を使用しています。
2. 青色光刺激に対する視覚的応答の可能性を排除するために、両方のフライラインはw⁺norpAバックグラウンドにあります。
3. 最終的な結果: w⁺norpA;G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. 成虫のハエが閉じた後、10μMオールトランスレチナル(ChR2に必要な共因子)を補充し、行動アッセイを行う前に3日間、光から保護された生鮮食品に選ばれたメスを入れます。

2. 10 μM オールトランスレティナルエンハンスフードを作る

1. 100mgのオールトランスレティナルを95%エタノールの17.6 mlに溶解し、20 mMのレティナルを作ります。常に光から保護されたすべてのトランスレティナルを保ちます。
2. 標準的なコーンミールフライ食品を電子レンジで溶かし、暖かくなるまで冷まして触れます。
3. 20 mM オールトランスレティナルの 50 μl を 10 ml のフライフードのバイアルに混ぜます。
4. バイアルを冷やして光から守りましょう。

3. 機器

1. ピペットのヒント:標準的な1,000 μlのピペットチップは先端の近くでカットされ、約2.25mmの細孔径を作成します。
2. プラットフォーム ( 図 1を参照)。
   1. デルリンベース、17 cm X 25 cmは、1/4 "NPTクーラントホースコネクタに合うように各コーナーにネジ穴で構築されました。
   2. デルリン製の垂直ホルダーは、ベースの中央に取り付けられています。全体の寸法は25 mm X 40 mm X 65 mm(幅Xの深さX高さ)です。10 mm幅の溝は、下部につまみねじを付けて、ホルダーの長さを実行します。プラットホームは、ホルダーの溝に合わせて直径3.5mmの穴を持つ、25ミリメートル×40ミリメートルX 10ミリメートル、ホルダーの上部に取り付けられています。
3. LED アレイ ( 図 1を参照)。
   1. 冷却剤ホースコネクタを使用して、プラットフォームベースに、約18cmの長さのクーラントホースの4本の腕が貼り付けられています。クーラントホースは構造サポートとしてのみ使用され、冷却目的には使用されません。
   2. 適切に配置された溝は各腕の冷却剤のホースの最後の部分に切り取り、各腕の端にヒートシンクを貼り付ける。
   3. 青色LED反乱トライスターは、プレカット熱粘着テープを使用して各ヒートシンクに取り付けられています。カルクロ18°トライレンズは、各トライスターに貼り付けられています。
   4. LEDトライスターは、BuckPuck DCドライバと電源装置に有線で接続されます。私たちは、シリーズの2トライスターに電力を供給する各BuckPuckとのセットアップを手配しました。
   5. 700 mA での 4 つの LED トライスターの照明は私達のプラットホームの713 W/m² の放射を生じる。
4. カメラ:カメラは小さな三脚に取り付けられ、プラットフォームの上部に焦点を当てています。

4. 行動アッセイ

1. 氷の上でハエを短時間麻酔します。
2. チップの両端を閉じるためにテープを使用して、ピペットの先端に個々のハエを配置します。
3. ハエが目を覚まし、ピペットの先端を積極的に探索した後、テープを取り外し、垂直ホルダーの溝にピペットを置きます。つまみねじは、ピペットチップを所定の位置に固定し、先端の底部を閉じるために使用されます。
4. フライがピペットチップ(通常は30〜60秒)を探索する場合、フライが先端からプラットフォームに現れる直前にカメラの録画を開始します。
5. フライがプラットフォームに現れた後、1~2秒待ってから、青いLEDをオンにします。タイマーを使用して、フライが飛行を開始するまでの時間を手動で測定します。

Representative Results

図1:垂直ホルダーと4つのクーラントホースアームが付いたLEDアレイを取り付けたヒートシンクを持つプラットフォームを示す実験的なセットアップ。 (A) アンビエントイルミネーション下のセットアップ。(B) LEDが点灯したときのセットアップ。(C) ヒートシンク上のトライスターLEDのクローズアップビュー。(D)トライレンズを装着したトライスターのクローズアップ。(E) バックパックドライバとLED回路の概略図。(F) バックパックと LED 回路の回路図。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20