드로소필라 광유전학: 신경 회로를 조작하는 방법

Overview

광유전학은 빛의 활성화가 뉴런의 상태에 있는 변경을 트리거하는 특정 opsins-빛 에 민감한 단백질을 표현하기 위하여 유전으로 조작된 신경을 조작하기 위하여 빛의 사용을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 opsin Channelrhodopsin2를 사용하여 Drosophila에 있는 optogenetic 접근을 기술합니다. 예제 프로토콜은 비행의 탈출 행동 뒤에 신경 회로를 연구하기 위하여 설정된 광유전학 분석체를 특징으로 합니다.

Protocol

이 프로토콜은 드 브리스와 클란딘에서 발췌, 드로소필라 멜라노가스터에서탈출 행동의 Optogenetic 자극,J. Vis. Exp. (2013). 

1. 채널로도프신 파리 생성

1. 크로스 UAS-ChR2 는 당신의 선택의 Gal4 드라이버와 비행, 우리는 G105-Gal4를 사용, 이는 광학 엽에서 포마-1 뉴런에서 표현된다.
2. 청색광 자극에 대한 시각적 반응의 가능성을 제거하기 위해 두 플라이 라인은 w⁺norpA 배경에 있습니다.
3. 최종 결과: w⁺norpA; G105-갈4/UAS-ChR2 +
4. 성인이 가까이 비행 한 후, 신선한 음식에 선택 된 여성을 넣어, 10 μM 모든 트랜스 망막 (ChR2에 필요한 공동 요인)로 보충하고 행동 분석을 수행하기 전에 3 일 동안 빛으로부터 보호.

2. 10 μM 전트랜스 망막 강화 식품 만들기

1. 20 mM 망막을 만들기 위해 95 % 에탄올의 17.6 ml에 100 mg의 모든 트랜스 망막을 녹입니다. 모든 트랜스 망막을 항상 빛으로부터 보호하십시오.
2. 표준 옥수수 가루 플라이 음식을 전자 레인지에 녹여 서 따뜻하게 만질 때까지 식힙니다.
3. 플라이 푸드 10ml의 바이알에 20mM 의 50 μl을 올 트랜스 망막으로 섞는다.
4. 바이알을 식히고 빛으로부터 보호하십시오.

3. 장비

1. 파이프 팁: 표준 1,000 μl 파이프 팁은 팁 근처에서 절단되어 ~ 2.25mm의 모공 직경을 만듭니다.
2. 플랫폼(그림 1참조).
   1. 17cm X 25cm의 Delrin 베이스는 1/4" NPT 냉각수 호스 커넥터에 맞게 각 모서리에 나사 구멍으로 구성되었습니다.
   2. 델린으로 만든 수직 홀더가 베이스 중앙에 부착되어 있습니다. 전체 치수는 25mm X 40mm X 65mm(너비 X 깊이 X 높이)입니다. 10mm 너비의 홈은 홀더의 길이를 실행하고 맨 아래에 엄지 손가락 나사가 있습니다. 플랫폼은 홀더의 상단에 부착, 25mm X 40mm X 10mm, 홀더의 홈과 정렬 3.5 mm 직경 구멍.
3. LED 배열(그림 1참조).
   1. ~18cm 길이의 냉각수 호스 4개의 암은 냉각수 호스 커넥터를 사용하여 플랫폼 베이스에 부착됩니다. 냉각수 호스는 구조 지원으로만 사용되며 냉각 목적으로 사용되지 않습니다.
   2. 제대로 간격이 있는 홈은 각 팔의 끝에 방열판을 부착하기 위해 각 팔의 냉각수 호스의 마지막 조각으로 절단됩니다.
   3. 파란색 LED 반란군 트라이-스타는 사전 절단 열 접착 테이프를 사용하여 각 방열판에 장착됩니다. Carclo 18° 트라이 렌즈는 각 트라이 스타에 부착되어 있습니다.
   4. LED 트라이 스타즈는 벅퍽 DC 드라이버와 지정된 전원 공급 장치에 연결됩니다. 우리는 시리즈에서 두 개의 트라이 스타전원 각 벅퍽과 우리의 설정을 준비했다.
   5. 700mA에서 4개의 LED 트라이 스타즈를 모두 조명하여 플랫폼에서 713 W/m^2의 돌격을 일으켰습니다.
4. 카메라: 카메라가 작은 삼각대에 장착되어 플랫폼 상단에 초점을 맞췄습니다.

4. 행동 분석

1. 얼음 에 파리를 잠시 마취.
2. 개별 파리를 파이프 팁에 넣고 테이프를 사용하여 팁의 양쪽 끝을 닫습니다.
3. 파리가 깨어나서 파이펫 팁을 적극적으로 탐색한 후 테이프를 제거하고 수직 홀더의 홈에 파이프를 놓습니다. 엄지 손가락 나사는 파이프 팁을 제자리에 고정하고 팁의 바닥을 닫는 데 사용됩니다.
4. 플라이가 파이펫 팁(일반적으로 30~60초)을 탐색할 때, 플라이가 팁에서 플랫폼으로 나오기 직전에 카메라 녹화를 시작합니다.
5. 플라이가 플랫폼에 나타난 후 1-2초를 기다린 후 파란색 LED를 켭니다. 타이머를 사용하여 비행이 비행을 시작할 때까지 시간을 수동으로 측정합니다.

Representative Results

그림 1: 수직 홀더와 LED 어레이가 부착된 방열판을 들고 있는 4개의 냉각수 호스 링 암이 있는 플랫폼을 보여주는 실험적인 설정입니다. (A)주변 조명 아래 설정. (B)LED가 켜지면 설정합니다. (C)방열판에 트라이 스타 LED의 클로즈업 보기. (D)트라이 렌즈가 부착된 트라이스타를 클로즈업합니다. (E)벅퍽 드라이버 및 LED 회로의 회로. (F)벅퍽 및 LED 회로에 대한 회로 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20