Drosophila Optogenetikk: En metode for å manipulere nevronale kretser

Overview

Optogenetikk gjør det mulig å bruke lys til å manipulere nevroner som er genetisk konstruert for å uttrykke spesifikke opsiner -lysfølsomme proteiner hvis lysaktivering utløser en endring i nevronens tilstand. Her beskriver vi en optogenetisk tilnærming i Drosophila ved hjelp av opsin Channelrhodopsin2. Eksempelprotokollen har en optogenetikkanalyse satt til å studere nevronalkretsen bak flyets rømningsadferd.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra de Vries og Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior i Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2013).

1. Generer Channelrhodopsin Fluer

1. Kryss UAS-ChR2 flyr med Gal4-driveren du velger, vi bruker G105-Gal4, som uttrykkes i Foma-1 nevroner i den optiske loben.
2. For å eliminere muligheten for en visuell respons på blålystimulering, er begge flylinjene i en w⁺norpA-bakgrunn.
3. Sluttresultat: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Etter at voksne flyr eclose, legg utvalgte kvinner på fersk mat, supplert med 10 μM all-trans-retinal (en kofaktor som kreves for ChR2) og beskyttet mot lys, i 3 dager før du utfører atferdsanalysen.

2. Lag 10 μM all-trans-retinal forbedret mat

1. Løs opp 100 mg all-trans-retinal i 17,6 ml 95% etanol for å gjøre 20 mM retinal. Hold all-trans-retinal beskyttet mot lys til enhver tid.
2. Smelt standard maismel fly mat i mikrobølgeovn, og la avkjøles til varm å berøre.
3. Bland 50 μl 20 mM all-trans-retinal i hetteglass med 10 ml fluemat.
4. La hetteglassene avkjøles og hold de beskyttet mot lys.

3. Utstyr

1. Pipetspisser: Standard 1000 μl pipetspisser kuttes nær spissen, og skaper en porediameter på ~ 2,25 mm.
2. plattformen (se figur 1).
   1. En Delrin-base, 17 cm X 25 cm, ble konstruert med gjengede hull i hvert hjørne for å passe til 1/4" NPT kjølevæskeslangekontakter.
   2. En vertikal holder, laget av Delrin, er festet til midten av basen. De totale målene er 25 mm X 40 mm X 65 mm (bredde X dybde X høyde). Et 10 mm bredt spor løper lengden på holderen, med en tommelskrue nederst. En plattform er festet til toppen av holderen, 25 mm X 40 mm X 10 mm, med et hull med en diameter på 3,5 mm på linje med sporet i holderen.
3. LED-rekker (se figur 1).
   1. Fire armer med kjølevæskeslange, ~18 cm lange, festes til plattformbasen ved hjelp av kjølevæskeslangekontakten. Kjølevæskeslangen brukes kun som strukturell støtte og brukes ikke til kjøleformål.
   2. Riktig fordelte spor kuttes inn i det siste stykke kjølevæskeslange på hver arm for å feste en kjøleribbe til enden av hver arm.
   3. En blå LED Rebel Tri-Stars er montert på hver kjøleribbe ved hjelp av forhåndskuttet termisk tape. En Carclo 18° Tri-linse er festet til hver Tri-Star.
   4. LED Tri-Stars er koblet til BuckPuck DC-driverne og en strømforsyning som spesifisert. Vi har arrangert oppsettet vårt med hver BuckPuck som driver to Tri-Stars i serien.
   5. Belysning av alle fire LED Tri-Stars på 700 mA ga en bestråling på 713 W / m² på plattformen vår.
4. Kamera: Kameraet er montert på et lite stativ og fokusert på toppen av plattformen.

4. Atferdsanalyse

1. Kort bedøve fluer på is.
2. Plasser individuelle fluer i pipetspisser, bruk tape for å lukke begge ender av spissen.
3. Etter at fluene har våknet og aktivt utforsker pipetspissen, fjern båndet og legg en pipet i sporet i vertikal holder. Tommelskruen brukes til å feste pipetspissen på plass og lukke bunnen av spissen.
4. Når fluen utforsker pipetspissen (vanligvis 30 - 60 sek), starter du kameraopptaket like før flyet kommer ut av spissen på plattformen.
5. Etter at flyet har dukket opp på plattformen, vent 1-2 sekunder, og slå på de blå lysdiodene. Bruk en tidtaker til å måle tiden manuelt til fluen starter flyvningen.

Representative Results

Figur 1: Eksperimentelt oppsett som viser plattformen med den vertikale holderen og de fire kjølevæskeslangearmene som holder kjøleribber med LED-arrayer festet til dem. (A) Oppsettet under omgivelsesbelysning. (B) Oppsettet når lysdiodene lyser. (C) Et nærbilde av en Tri-Star LED på kjøleelementet. (D) Et nærbilde av Tri-Star med tri-linsen festet. (E) Et skjema av Buckpuck Driver og LED-kretsen. (F) Kretsdiagram for BuckPuck- og LED-kretsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20