Drosophila Optogenética: Um Método para Manipular Circuitos Neuronais

Overview

A optogenética permite o uso da luz para manipular neurônios geneticamente modificados para expressar opsinas específicas - proteínas sensíveis à luz cuja ativação da luz desencadeia uma mudança no estado do neurônio. Aqui descrevemos uma abordagem optogenética em Drosophila usando o opsin Channelrhodopsin2. O protocolo de exemplo apresenta um ensaio optogenético definido para estudar os circuitos neuronais por trás do comportamento de fuga da mosca.

Protocol

Este protocolo é um trecho de de Vries e Clandinin, Optogentic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2013).

1. Gerar moscas channelrhodopsin

1. Cross UAS-ChR2 voa com o motorista Gal4 de sua escolha, usamos G105-Gal4, que é expresso em neurônios Foma-1 no lobo óptico.
2. Para eliminar a possibilidade de uma resposta visual à estimulação da luz azul, ambas as linhas de mosca estão em um fundo w⁺norpA.
3. Resultado final: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Após moscas adultas eclose, coloque fêmeas selecionadas em alimentos frescos, complementadas com 10 μM all-trans-retinal (um cofator necessário para ChR2) e protegidas da luz, por 3 dias antes de realizar o ensaio comportamental.

2. Faça 10 μM All-trans-retinal Enhanced Food

1. Dissolva 100 mg de toda a retina trans em 17,6 ml de 95% de etanol para fazer retina de 20 mM. Mantenha toda a retina trans protegida da luz o tempo todo.
2. Derreta alimentos padrão de mosca de fubá no micro-ondas e deixe esfriar até aquecer para tocar.
3. Misture 50 μl de 20 mM de toda trans-retina em frascos de 10 ml de comida de mosca.
4. Deixe os frascos esfriarem e mantenha-se protegidos da luz.

3. Equipamento

1. Pontas de tubulação: As pontas padrão de 1.000 μl pipet são cortadas perto da ponta, criando um diâmetro de poros de ~2,25 mm.
2. Plataforma (ver Figura 1).
   1. Uma base delrin, de 17 cm X 25 cm, foi construída com orifícios roscados em cada canto para caber conectores de mangueira de refranhamento NPT de 1/4".
   2. Um suporte vertical, feito de Delrin, é anexado ao centro da base. As dimensões gerais são 25 mm X 40 mm X 65 mm (largura X profundidade X altura). Uma ranhura de 10 mm de largura percorre o comprimento do suporte, com um parafuso de polegar na parte inferior. Uma plataforma é anexada à parte superior do suporte, 25 mm X 40 mm X 10 mm, com um orifício de 3,5 mm de diâmetro alinhado com a ranhura no suporte.
3. Matrizes led (ver Figura 1).
   1. Quatro braços de mangueira de refrigerante, ~18 cm de comprimento, são afixados na base da plataforma usando o conector da mangueira de refratante. A mangueira de refrigeração é usada apenas como suporte estrutural e não é usada para fins de resfriamento.
   2. As ranhuras adequadamente espaçadas são cortadas na peça final de resfriação de cada braço para fixar um dissipador de calor na extremidade de cada braço.
   3. Um LED Tricolor azul é montado em cada dissipador de calor usando fita adesiva térmica pré-cortada. Uma trícmida Carclo 18° é afixada a cada Tri-Star.
   4. O LED Tri-Stars está conectado aos drivers BuckPuck DC e a uma fonte de alimentação conforme especificado. Nós organizamos nossa configuração com cada BuckPuck alimentando dois Tri-Stars em série.
   5. A iluminação de todos os quatro Led Tri-Stars a 700 mA rendeu uma irradiação de 713 W/m² em nossa plataforma.
4. Câmera: A câmera é montada em um pequeno tripé e focada na parte superior da plataforma.

4. Ensaio Comportamental

1. Brevemente anestesize moscas no gelo.
2. Coloque moscas individuais em pontas de pipet, usando fita adesiva para fechar as duas extremidades da ponta.
3. Depois que as moscas acordarem e estiverem explorando ativamente a ponta da tubulação, remova a fita e coloque uma tubulação na ranhura no suporte vertical. O parafuso é usado para fixar a ponta da tubulação no lugar e fechar a parte inferior da ponta.
4. À medida que a mosca explora a ponta pipeta (tipicamente 30 - 60 segundos), inicie a gravação da câmera pouco antes da mosca emergir da ponta para a plataforma.
5. Depois que a mosca emergiu na plataforma, espere de 1 a 2 segundos, e ligue os LEDs azuis. Use um temporizador para medir manualmente o tempo até que a mosca inicie o voo.

Representative Results

Figura 1: Configuração experimental mostrando a plataforma com o suporte vertical e os quatro braços de resfriação segurando dissipadores de calor com matrizes led afixadas a eles. (A) A configuração sob iluminação ambiente. (B) A configuração quando os LEDs estiverem iluminados. (C) Uma visão de perto de um LED Tri-Star na pia de calor. (D) Um close-up da Tri-Star com a tríplice lente presa. (E) Um esquema do driver buckpuck e circuito de LED. (F) Diagrama do circuito para o circuito buckpuck e led. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20