Дрозофила Оптогенетика: метод манипулирования нейронными цепями

Overview

Оптогенетика позволяет использовать свет для манипулирования нейронами, которые генетически модифицированы, чтобы выразить специфические опсины-светочувствительные белки, активация света которых вызывает изменение состояния нейрона. Здесь мы описываем оптогенетический подход в Drosophila с помощью opsin Channelrhodopsin2. В примере протокола содержится анализ оптогенетики, установленный для изучения нейрональной схемы, которая стоит за поведением мухи.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из де Врис и Clandinin, Оптигенетическая стимуляция побега Поведение в Drosophila меланогастер, J. Vis. Exp. (2013).

1. Создать Channelrhodopsin мух

1. Кросс UAS-ChR2 летает с водителем Gal4 по вашему выбору, мы используем G105-Gal4, который выражается в нейронах Foma-1 в оптической доле.
2. Чтобы исключить возможность визуальной реакции на стимуляцию синего света, обе линии мухи находятся в фоновом^режимеw и norpA.
3. Конечный результат: w^иnorpA; G105-Gal4/UAS-ChR2
4. После того, как взрослые мухи eclose, положить отдельных женщин на свежие продукты питания, дополняется 10 МК все транс-сетчатки (со-фактор, необходимый для ChR2) и защищены от света, в течение 3 дней до выполнения поведенческого анализа.

2. Сделать 10 МКМ Все-транс-сетчатки Расширенный продовольствия

1. Растворите 100 мг полностью транс-сетчатки в 17,6 мл 95% этанола, чтобы сделать 20 мМ сетчатки. Держите все-транс-сетчатки защищены от света во все времена.
2. Растопить стандартную кукурузную муки летать пищи в микроволновой печи, и дайте остыть до теплого на ощупь.
3. Смешайте 50 мкл из 20 мМ все-транс-сетчатки во флаконы 10 мл мухи пищи.
4. Пусть флаконы остыть и держать защищены от света.

3. Оборудование

1. Советы pipet: Стандартные наконечники трубы 1000 мкл разрезаются вблизи кончика, создавая диаметр поры 2,25 мм.
2. Платформа (см. рисунок 1).
   1. База Delrin, 17 см X 25 см, была построена с резьбовыми отверстиями на каждом углу, чтобы соответствовать 1/4"NPT разъемы шланга для охлаждения.
   2. Вертикальный держатель, сделанный из Делрина, крепится к центру основания. Общие размеры 25 мм X 40 мм X 65 мм (ширина X глубина X высота). 10 мм широкий паз проходит длина держателя, с большим пальцем винт в нижней части. Платформа крепится к верхней части держателя, 25 мм X 40 мм X 10 мм, с отверстием диаметром 3,5 мм выровнены с пазом в держателе.
3. Светодиодные массивы (см. рисунок 1).
   1. Четыре руки шланга для охлаждения длиной 18 см прикреплены к основанию платформы с помощью разъема шланга для охлаждения. Шланг охлаждающей жидкости используется только в качестве структурной поддержки и не используется для целей охлаждения.
   2. Правильно размытые канавки разрезаются на окончательный кусок шланга теплорежумки каждой руки, чтобы прикрепить теплооттонку к концу каждой руки.
   3. Синий светодиод Rebel Tri-Stars устанавливается на каждую тепловую раковину с помощью предварительно вырезанной тепловой клейкой ленты. Три-линзы Carclo 18 "прикрепляются к каждой Tri-Star.
   4. Светодиодные Tri-Stars подключены к драйверам BuckPuck DC и источнику питания, как указано. Мы организовали нашу настройку с каждым BuckPuck питания двух Tri-Stars в серии.
   5. Освещение всех четырех светодиодных Tri-Stars на 700 мА дало облучение 713^{Вт/м 2} на нашей платформе.
4. Камера: Камера установлена на небольшом штативе и ориентирована на верхней части платформы.

4. Поведенческий анализ

1. Кратко обезболивать мух на льду.
2. Поместите отдельные мухи в трубы советы, используя ленту, чтобы закрыть оба конца кончика.
3. После того, как мухи проснулись и активно исследуют кончик трубы, снимите ленту и поместите трубу в паз в вертикальном держателе. Thumbscrew используется для обеспечения наконечник трубы на месте и закрыть нижнюю часть кончика.
4. Как муха исследует пипетки отзыв (как правило, 30 - 60 сек), начать запись камеры как раз перед мухой выходит из кончика на платформу.
5. После того, как муха вышла на платформу, подождите 1-2 секунды и включите синие светодиоды. Используйте таймер, чтобы вручную измерить время, пока муха не начнет полет.

Representative Results

Рисунок 1: Экспериментальная настройка, показывающая платформу с вертикальным держателем и четырьмя холодными шлангами, держащими тепловые раковины со светодиодными массивами, прикрепленными к ним. (A)Настройка под окружающим освещением. (B)Настройка при освещении светодиодов. (C) крупным планом вид Tri-Star светодиод на тепло раковине. (D)крупным планом Tri-Star с три-линзы прилагается. (E)Схема водителя Buckpuck и светодиодной цепи. (F)Схема цепи для BuckPuck и светодиодной цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20