성인 비행에서 Midgut의 해부 : 소화관을 격리하는 방법

Overview

이 비디오에서는 장 줄기 세포를 격리하기 위해 성인 Drosophila 장의 해부와 단일 세포 해리 및 FACS에 적합한 미드 구트 컬렉션을 강조합니다.

Protocol

이 프로토콜은 Tauc 외에서발췌 ., 노화 중 줄기 세포 행동을 연구하기 위해 FACS에 의해 성인 Drosophila Midguts에서 장 줄기 세포를 분리, J. Vis. Exp. (2014).

참고: 이 프로토콜이 FAC 정렬에 의해 ISC를 분리하는 데 처음으로 사용되는 경우, 다음 컨트롤은 처음에 FACS 매개 변수를 제대로 설정하기 위해 필수입니다 : 야생 유형에서 분리 된 세포 (예 : w¹¹¹⁸⁾Sytox없이 Drosophila midguts. 야생 유형(예: w^1118)에서분리된 세포(예: Sytox를 가진 Drosophila midguts).. Sytox없이 esg-Gal4, UAS-GFP 비행 선의 중간 구트에서 분리 된 세포.

1. 창자 해부를위한 솔루션 및 요리 준비

1. esg-Gal4, UAS-GFP 플라이 라인에서 40마리의 암컷 파리를 포함하는 4-6개의 바이알을 각각 준비합니다.
2. 10x PBS 스톡 솔루션으로부터 500ml 1x PBS(1.8m NaH₂PO₄· _H2O, 8.4 mM Na₂HPO_{4·2H 2}O, 175 mM NaCl, pH를 7.4로 조정한다.
3. 1x PBS(3.5g 전기전도등급 아가로즈 100ml 1x PBS)로 3.5% 아가로즈 용액을 준비한다. 이 용액을 페트리 접시(직경 8.5cm)에 부어 바닥을 덮어 해부 플레이트를 준비합니다. 아가로즈 층은 해부 절차 중에 집게의 끝을 손상시키는 것을 방지합니다. 겔이 고화된 후 해부 플레이트를 4°C로 저장하였다.
4. 해부하기 전에 1x PBS + 1 % BSA 의 300ml를 준비하고 얼음이나 4 ° C에 병을 놓습니다.
5. 원심분리기를 켜고 4°C로 식힙니다.
6. 가장자리를 부드럽게 하기 위해 2 개의 유리 파스퇴르 파이펫의 팁을 화염.
7. 집게 2쌍과 면도날 1개를 70%에탄올로 청소합니다.
8. 얼음 에 해부 된 미드 구트를 수집하기 위한 4 ~ 6 1.5 ml 마이크로 원심 분리 튜브를 놓습니다.

2. 위장관 및 미드구트의 해부 준비

1. 표준 플라이 베드에 CO_2가 있는 유리병(40파리)에서 비행하는 마취를 하고 면도날을 사용하여 모든 파리를 참수하고 해부 접시로 옮겨냅니다. 차가운 1x PBS/1% BSA 용액을 해부 접시에 부어 아가로즈 젤을 덮습니다. 파리가 떠있습니다.
2. 다른 한 쌍의 집게와 흉부를 들고 있는 동안 한 쌍의 집게로 날아다니는 복부를 잡아보세요. 흉부와 복부를 분리합니다. 창자가 표시 되고 전동/작물은 여전히 흉부에 연결 될 것입니다.
3. 용기를 잡고 흉부에서 꺼냅니다. 용기를 펼치려면 작물을 잡고 복부에서 약간 앞쪽으로 용기를 당깁니다.
4. 한 쌍의 집게와 앞쪽으로 열린 표피의 가장자리로 복부의 뒤쪽 끝을 다른 한 쌍의 집게와 함께 잡아. 돌출된 창자 조직을 파괴하지 않도록 주의하십시오. 뒤쪽 끝을 당겨 표피를 부수고 전체 장이 복강에서 꺼낼 때까지 매우 부드럽게 후방으로 당겨계속 합니다. 자르기는 신체 구멍을 통해 맞게 너무 큰 경우 사전에 제거 해야 할 수 있습니다.
5. 전구, 말피기안 튜블러, 힌구트, 난소를 제거하여 맨손으로 미드구트를 남깁니다.
6. 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 해부된 미드구트의 배치를 차가운 1x PBS/1% BSA 용액을 포함하는 1.5ml 마이크로 센심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 보관합니다. 샘플은 2시간 이내에 처리되어야 합니다.
7. 전체 배치의 해부가 완료되면 해부 접시에 이중 증류수로 헹구어 잔해 위로 씻어내도록 합니다. 중간 구트의 다음 배치를 해부하기 시작합니다 (반복 단계 2.1-2.7). 2시간 이내에 가능한 한 많은 일괄 처리를 해부한 다음 3.1 단계로 진행합니다.

3. FAC 정렬을 위해 세포를 수확하는 장 조직의 소화

1. 미드구트에서 1x PBS/1% BSA 용액을 제거하고 각 샘플에 0.5% 트립신-EDTA 용액의 500 μl을 추가합니다.
2. 20 초 동안 잘 소용돌이와 25-30 분 동안 실온에서 20 rpm에서 부드러운 흔들 / 회전으로 샘플을 배양합니다.
3. 약 30 분 후에 다시 소용돌이하고 그대로 중간 구이 조직이 튜브의 바닥에 가라 앉게하십시오. 화염 유리 파스퇴르 파이펫으로 현탁액에있는 세포를 조심스럽게 제거하고 신선한 1.5 ml 마이크로 센트 심분리기 튜브에 35 μm 나일론 메쉬를 통해 필터링합니다.
4. 4°C에서 5분 동안 100 x g에서 셀을 아래로 회전시합니다. 참고, 소화를 시작할 때, 세포 펠릿은 처음에 보이지 않을 지도 모르지만 조직 소화가 진행됨에 따라 눈에 띄게 될 것입니다.
   1. 트립신 용액을 나머지 그대로 중간 구이 조직을 포함하는 원래 샘플 튜브로 조심스럽게 옮김합니다. 펠릿에서 너무 많은 세포를 전송하지 마십시오.
   2. 감기 1x PBS/1% BSA의 400 μl에서 셀 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 얼음에 해리된 세포를 포함하는 미세 원심 분리기 튜브를 유지하고 빛으로부터 세포를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮습니다.
   3. 소용돌이 트립신 용액은 다시 남아있는 그대로 중간 구이 조직을 포함하는 실온에서 또 다른 30 분 동안 로커에 샘플을 배치합니다.
5. 모든 미드구트 조직이 소화될 때까지 3.3~ 3.4.3단계를 반복합니다. 모든 미세 원심 분리기 튜브의 해리 된 세포를 하나의 미세 원심 분리 튜브로 결합합니다. 이는 결합된 모든 세포 현탁액의 부피가 1.5 ml를 초과할 수 있기 때문에 3.4에서와 같이 원심분리 단계를 요구할 수 있다. 얼음에 세포 현탁액을 유지하고 빛으로부터 세포를 보호합니다.
6. 해리된 세포를 4°C에서 5분 동안 100 x g로 아래로 회전시합니다. 마이크로 센티슈지 튜브에 있는 1x PBS/1% BSA 용액의 약 50-100 μl을 남기는 가능한 한 많은 상체를 조심스럽게 제거하십시오. Sytox (1:20,000)를 포함하는 800 μl 1x PBS/1% BSA에서 해리 된 세포를 부드럽게 재연합니다.
7. 셀 스트레이너 스냅 캡(35 μm 나일론 메쉬)을 통해 세포를 필터링하여 셀 서스펜션을 5ml 원형 하단 팔콘 튜브로 전송합니다. 항상 얼음에 세포 샘플을 유지하고 빛으로부터 보호합니다. 이제 셀을 정렬할 준비가 되었습니다.
8. 세포가 후속 RNA 절연을 위해 정렬될 각 미세 원심 분리기 튜브로 RNAlater 용액의 Pipette 600 μl. 다른 다운스트림 응용 프로그램의 경우 세포는 멸균 PBS와 같은 다른 용액으로 수집될 수 있다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5	Fine Science Tools	11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh)	Sefar	3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Polymax 1040	Heidolph	543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA	Invitrogen	15400-054	Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry	Life Technologies	S34857
RNAlater Stabilization Solution	Life Technologies	AM7023	Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter	Becton Dickinson		Turn on one hour prior to sorting