Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Midgut'un Yetişkin Bir Sinekten Diseksiyonu: Sindirim Sistemini izole Etmek İçin Bir Yöntem

Overview

Bu videoda, erişkin Drosophila bağırsağının diseksiyonunu ve bağırsak kök hücrelerini izole etmek için tek hücreli ayrışma ve FACS için uygun midgutların toplanmasını vurguluyoruz.

Protocol

Bu protokol, Tauc ve ark.'dan bir alıntıdır, Yetişkin Drosophila Midguts'tan Bağırsak Kök HücreleriniN YAŞLANMA Sırasında Kök Hücre Davranışını İncelemek için İzolasyon, J. Vis. Exp. (2014).

NOT: Bu protokol, ISC'leri FAC sıralama ile yalıtmak için ilk kez kullanılıyorsa, BAŞLANGıÇTA FACS parametrelerini düzgün ayarlamak için aşağıdaki denetimler zorunludur: Vahşi türden ayrışmış hücreler (örneğin, w1118) Sytox içermeyen Drosophila midguts. Vahşi tipten ayrışmış hücreler (örneğin w1118)Sytox ile Drosophila midguts (bkz. Adım 3.6). Sytox olmadan esg-Gal4, UAS-GFP uçuş hattının midgutlarından ayrışmış hücreler.

1. Bağırsak Diseksiyonu için Çözeltilerin ve Yemeklerin Hazırlanması

  1. Her biri esg -Gal4, UAS-GFP sinek hattından 40 dişi sinek içeren 4-6şişe hazırlayın.
  2. 10x PBS stok çözeltisinden 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH 2 PO4)hazırlayın· H2O, 8,4 mM Na2HPO4·2H2O, 175 mM NaCl, pH'ı 7,4'e ayarlayın).
  3. 1x PBS'de %3,5 agarose çözeltisi hazırlayın (100 ml 1x PBS'de 3,5 g elektroforezi sınıfı agarose). Bu çözeltiyi altını örtmek için petri kaplarına (çap 8,5 cm) dökerek diseksiyon plakaları hazırlayın. Agarose tabakası, diseksiyon prosedürü sırasında antips uçlarına zarar verilmesini önler. Jel katılaştıktan sonra diseksiyon plakalarını 4 °C'de saklayın.
  4. Parçalamadan önce 300 ml 1x PBS + % 1 BSA taze hazırlayın ve şişeyi buza veya 4 °C'ye yerleştirin.
  5. Santrifüjü açın ve 4 °C'ye kadar soğumaya bırakın.
  6. Kenarları yumuşatmak için 2 cam Pasteur pipet uçlarını alevleyin.
  7. İki çift forseps ve bir jilet% 70 etanol ile temizleyin.
  8. Parçalanmış midgutları buz üzerinde toplamak için dört ila altı 1,5 ml mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.

2. Gastrointestinal Sistemin Hazırlanması ve Midgut Diseksiyonu

  1. Standart bir sinek yatağında CO 2 ile bir şişeden(40 sinek) sinekleri uyuşturun, jilet kullanarak tüm sineklerin kafasını kesin ve diseksiyon kabına aktarın. Agarose jelini örtmek için diseksiyon kabına soğuk 1x PBS/% 1 BSA çözeltisi dökün. Sinekler yüzecek.
  2. Toraksı diğer bir çift tokapsla tutarken, sinek karnını bir çift tokapsla tutun. Toraksı karından ayırın. Bağırsak görünür olacak ve öncül / mahsul büyük olasılıkla hala toraksa bağlı olacaktır.
  3. Bağırsağı tut ve torakstan çıkar. Bağırsakları açılmak için, mahsulü alın ve bağırsağı karından biraz çekin.
  4. Karın arka ucunun bir çift ön ucu ve ön açık manikürün kenarını diğer çift mandiyansla tutun. Çıkıntılı bağırsak dokusunu yok etmemeye dikkat edin. Manikür kırmak için arka ucu çekin ve tüm bağırsak karın boşluğundan çekilene kadar arka kısmı çok nazikçe çekmeye devam edin. Vücut boşluğuna sığmayacak kadar büyükse, mahsulün önceden çıkarılması gerekebilir.
  5. Önseziyi, Malpighian tübüllerini, arkalığı ve yumurtalıkları çıplak midgut bırakarak çıkarın.
  6. Cam pastör pipet kullanarak, parçalanmış midgutların grubunu soğuk 1x PBS / 1% BSA çözeltisi içeren 1,5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü buzda tutun. Numuneler 2 saat içinde işlenmelidir.
  7. Bir partinin tamamının diseksiyonu tamamlandıktan sonra, diseksiyon kabını döküntülerin üzerinde kalan yıkamak için çift damıtılmış su ile durulayın. Bir sonraki midgut grubunu parçalamaya başlayın (Adım 2.1–2.7'yi yineleyin). 2 saat içinde mümkün olduğunca çok partiyi parçalara ayrıştırın, ardından Adım 3.1'e geçin.

3. FAC Sıralama için Hücreleri Hasat Etmek için Bağırsak Dokusunun Sindirimi

  1. 1x PBS/%1 BSA çözeltisini midgutlardan çıkarın ve her numuneye %0,5 Trypsin-EDTA çözeltisinin 500 μl'sini ekleyin.
  2. Vortex 20 saniye boyunca iyi ve 25-30 dakika boyunca oda sıcaklığında 20 rpm'de hafif sallanarak / döndürerek örnekleri kuluçkaya yatırın.
  3. Yaklaşık 30 dakika sonra tekrar girdap ve sağlam midgut dokusunun tüpün dibine batmasına izin verin. Süspansiyonda bulunan hücreleri alevli bir cam Pasteur pipetle dikkatlice çıkarın ve 35 μm'lik bir naylon ağdan yeni bir 1,5 ml mikrosantrifüj tüpüne filtreleyin.
  4. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 100 x g'da aşağı çevirin. Not olarak, sindirimi başlatırken, bir hücre peledi ilk başta görünmeyebilir, ancak doku sindirimi ilerledikçe görünür hale gelecektir.
    1. Trypsin çözeltisini, kalan sağlam midgut dokusunu içeren orijinal numune tüpüne dikkatlice aktarın. Peletten çok fazla hücre transfer etmekten kaçının.
    2. Hücre peletini 400 μl soğuk 1x PBS/% 1 BSA'da hafifçe yeniden askıya alın. Ayrışmış hücreleri içeren mikrosantrifüj tüplerini buz üzerinde tutun ve hücreleri ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün.
    3. Kalan sağlam midgut dokusunu içeren Trypsin çözeltisini tekrar girdaplayın ve numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika daha sallayıcıya yerleştirin.
  5. Tüm midgut dokusu sindirilene kadar 3.3 ile 3.4.3 adımlarını tekrarlayın. Tüm mikrosantrifüj tüplerindeki ayrışmış hücreleri tek bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Bu, 3,4'te olduğu gibi bir santrifüjleme adımı gerektirebilir, çünkü birleştirilen tüm hücre süspansiyonlarının hacmi 1,5 ml'yi aşabilir. Hücre süspansiyonu buzda tutun ve hücreleri ışıktan koruyun.
  6. Ayrışmış hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 100 x g'da aşağı çevirin. Mikrosantrifüj tüpünde 1x PBS/% 1 BSA çözeltisinin yaklaşık 50-100 μl'sini bırakarak süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın. Sytox (1:20.000) içeren 800 μl 1x PBS/%1 BSA'da ayrışmış hücreleri hafifçe yeniden biriktirin.
  7. Hücreleri bir hücre süzgeç süzgeç kapağından (35 μm naylon ağ) filtre ederek hücre süspansiyonunu 5 ml yuvarlak alt Falcon tüpüne aktarın. Hücre örneklerini her zaman buzda tutun ve ışıktan koruyun. Hücreler artık sıraya hazır.
  8. Pipet 600 μl RNAlater çözeltisi, hücrelerin sonraki RNA yalıtımı için sıralanacağı her mikrosantrifüj tüpüne. Diğer aşağı akış uygulamaları için hücreler, örneğin steril PBS gibi farklı bir çözeltide toplanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 Fine Science Tools 11252-20
SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) Sefar 3A03-0150-102-00
Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
Polymax 1040 Heidolph 543-42210-00
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma A4503-50G
0.5% Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054 Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity
and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly.
SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry Life Technologies S34857
RNAlater Stabilization Solution Life Technologies AM7023 Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation
FACSAria II cell sorter Becton Dickinson Turn on one hour prior to sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Boş Değer Sorun
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter