ड्रोसोफिला हार्ट की तैयारी: वयस्क मक्खी में हार्ट फिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक तकनीक

Overview

यह वीडियो मक्खी के वयस्क दिल का वर्णन करता है, या अन्यथा ड्रोसोफिला पृष्ठीय पोत कहा जाता है। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल लाइव दिल की तैयारी के लिए एक विच्छेदन प्रक्रिया को दर्शाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल वोगलर और ओकोर का एक अंश है, जो ड्रोसोफिला,जे विस एक्सप्रेस में बीटिंग हार्ट की कल्पनाकरता है। (2009). 

1. शुरू करने से पहले

1. हौसले से 108mM Na +, 5mM K^+,युक्त कृत्रिम हीमोलिम्फ (एएच) समाधान तैयार करें 2mM Ca^2+,8mM MgCl_2,1mM NaH₂पीओ_4,4mM NaHCO_3,10mM सुक्रोज, 5mM trehalose, 5m HEPES (पीएच 7.1, सिग्मा केमिकल्स से सभी reagents) । जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए उपयोग करने से ठीक पहले फ्रिज में स्टॉक समाधानों से एसक्रोज और ट्रेहलोज को एएच में जोड़ा जाना चाहिए।
2. कमरे के तापमान के लिए आह लाओ और कम से कम 15 मिनट के लिए हवा बुदबुदाती द्वारा समाधान ऑक्सीजन।
3. वसा को हटाने के लिए आवश्यक कई ठीक केशिकाएं (जैसे ग्लास केशिकाएं, 100ul, VWR) खींचें।

2. वयस्क मक्खी से अर्द्ध बरकरार ड्रोसोफिला हार्ट

1. वयस्क ड्रोसोफिला मक्खियों को फ्लाई नैप (कैरोलिना बायोलॉजिकल सप्लाई कंपनी) के साथ 2-5 मिनट के लिए एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है। लंबे समय तक एक्सपोजर के लिए फ्लाई झपकी में मक्खियों को छोड़ने के लिए देखभाल नहीं की जानी चाहिए। ठंड के लिए अल्पकालिक जोखिम भी मक्खियों को एनेस्थेटाइज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन सीओ₂ की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि यह हृदय गति और लयबद्धता पर लंबे समय तक चलने वाले प्रभावों का होता है।
2. एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों को रखा जाता है, पृष्ठीय पक्ष नीचे, पेट्रोलियम जेली की एक पतली परत के साथ लेपित पेट्री डिश में। पंखों और शरीर में हाइड्रोफोबिक क्यूटिकल जेली के लिए "छड़ी" लेकिन जरूरत पड़ने पर फ्लाई को फिर से तैनात किया जा सकता है। यह बाद के जोड़तोड़ के दौरान विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो जाता है।
3. एक प्रारंभिक कटौती वसंत कैंची (रोबोज #5611) की एक घुमावदार जोड़ी का उपयोग करके की जाती है। कैंची ब्लेड पैरों के नीचे रखा जाता है और गर्दन के पास छाती की पृष्ठीय सतह की ओर नीचे angled। सिर, वेंट्रल नर्व कॉर्ड और पैरों को एक ही कट से हटा दिया जाता है। तैयारी तो एक ऑक्सीजनयुक्त, कृत्रिम हीमोलिम्फ (एएच) समाधान में जलमग्न है ।
4. वसंत कैंची का उपयोग करते हुए पेट के पीछे की नोक (पेट के खंडों 7 और 8 के शामिल) को एक ही कटौती के साथ हटा दिया जाता है। यह पेट के दोनों किनारों के साथ पार्श्व कटौती करने के लिए उपयोग प्रदान करता है और पीछे के आंत और पेट क्यूटिकल के बीच संबंध को तोड़ने का कार्य करता है। इसके बाद वेंट्रल पेट क्यूटिकल का मुक्त फ्लैप निकल जाता है।
5. चरण 3 और 4 में पेट के पूर्वकाल और पीछे के कनेक्शन कटे होते हैं इसलिए पेट के अंगों को अब केवल श्वासनली द्वारा ही जगह में रखा जाता है। आंत और अन्य पेट के अंगों को आमतौर पर जौहरी के संदंश (रोबोज, #55) और कोमल टगिंग का उपयोग करके एक द्रव्यमान के रूप में हटाया जा सकता है। आंतरिक अंगों को हटाने से पता चलता है कि धड़कन दिल की नली अभी भी वसा शरीर से घिरे पृष्ठीय क्यूटिकल से जुड़ी है।
6. हल्के माइक्रोस्कोप में वसा शरीर काफी अपारदर्शी होते हैं नतीजतन दिल की नली को स्पष्ट रूप से देखने के लिए अक्सर इस वसा में से कुछ को हटाना आवश्यक होता है। यह पतले तैयार ग्लास केशिकाओं का उपयोग करके एक लिपोसक्शन तकनीक द्वारा पूरा किया जाता है। केशिकाएं एक मानक पिपेट पुलर (जैसे सूटर पी-97 पिपेट पुलर) का उपयोग करके बनाई जाती हैं और फिर वैक्यूम स्रोत से जुड़ी प्लास्टिक ट्यूबिंग (टायगॉन, 1/16") में डाली जाती हैं। इस प्रणाली का उपयोग हृदय नली के चारों ओर से अतिरिक्त वसा को सक्शन करने के लिए किया जाता है। सक्शन बल व्यास को टिप करने के लिए आनुपातिक है, इसलिए व्यास में 40 माइक्रोन से बड़े सुझावों के साथ पिपेट का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। दिल को छूने से बचने के लिए अत्यधिक सावधानी बरती जानी चाहिए और क्योंकि दिल का पीछे का हिस्सा बहुत नाजुक है कि क्षेत्र से पूरी तरह बचा जाना चाहिए।
7. वयस्क ड्रोसोफिला हार्ट ट्यूब अब उजागर हो गया है और धड़क रहा होना चाहिए। यदि आवश्यक हो, तो क्यूटिकल और संलग्न दिल को धीरे-धीरे पेट्रोलियम जेली से बाहर निकालकर और ध्यान से इसे वापस नीचे टैम्पिंग करके, फिर से दिल के ऊतकों के साथ किसी भी संपर्क से बचने के द्वारा फिर से स्थापित किया जा सकता है। इस बिंदु पर समाधान स्नान की तैयारी को ताजा एएचएल के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। इस तैयारी को किसी भी जोड़तोड़ से पहले ऑक्सीजन के साथ 20-30 मिनट के लिए संतुलन की अनुमति दी जानी चाहिए। यदि तैयारी को 60 मिनट से अधिक समय तक बनाए रखा जाना है तो इसे ताजा एएचएल के साथ छिद्रित किया जाना चाहिए।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical