Preparação do Coração de Drosophila: Uma Técnica para Estudar Fisiologia do Coração na Mosca Adulta

Overview

Este vídeo descreve o coração adulto da mosca, ou de outra forma chamado de vaso dorsal Drosophila. O protocolo em destaque demonstra um procedimento de dissecção para preparações cardíacas vivas.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Vogler e Ocorr, Visualizando o Coração Pulsante em Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. Antes de começar

1. Prepare recentemente a solução de hemoglifo artificial (AH) contendo 108mM Na⁺, 5mM K+, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM sacarose, 5mM trehalose, 5mM HEPES (pH 7.1, todos reagentes da Sigma Chemicals). A sacarose e o trehalose devem ser adicionados à AH a partir de soluções de estoque refrigerados pouco antes de serem utilizados, a fim de evitar a contaminação bacteriana.
2. Leve a AH à temperatura ambiente e oxigene a solução borbulhando por pelo menos 15 minutos.
3. Puxe vários capilares finos (por exemplo, Capilares de Vidro, 100ul, VWR) necessários para a remoção de gordura.

2. Coração de Drosophila semi-intacto da mosca adulta

1. Moscas de Drosophila adultas são anestesiadas com Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) por 2-5 minutos. Deve-se tomar cuidado para não deixar as moscas no Cochilo da Mosca para exposições mais longas. A exposição a curto prazo ao frio também pode ser usada para anestesiar moscas, mas o CO₂ não é recomendado, pois tem efeitos mais duradouros na frequência cardíaca e na ritmética.
2. Moscas anestesiadas são colocadas, lado dorsal para baixo, em uma placa de Petri revestida com uma fina camada de geleia de petróleo. A cutícula hidrofóbica nas asas e o corpo reversivelmente "grudam" na geleia, mas a mosca pode ser reposicionada se necessário. Isso se torna especialmente importante durante as manipulações subsequentes.
3. Um corte inicial é feito usando um par curvo de tesoura de mola (Roboz #5611). As lâminas da tesoura são colocadas sob as pernas e inclinadas para baixo em direção à superfície dorsal do tórax perto do pescoço. A cabeça, o fio do nervo ventral e as pernas são removidos com um único corte. A preparação é então submersa em uma solução hemolífia artificial (AH) oxigenada.
4. Com a tesoura de mola, a ponta posterior do abdômen (composta pelos segmentos abdominais 7 e 8) é removida com um único corte. Isso dá acesso para fazer cortes laterais ao longo das duas bordas do abdômen e serve para cortar a conexão entre o intestino posterior e a cutícula abdominal. O retalho liberado da cutícula abdominal ventral é então removido.
5. Nas etapas 3 e 4 as conexões anteriores e posteriores do intestino são cortadas para que os órgãos abdominais sejam agora mantidos no lugar apenas por traqueols. O intestino e outros órgãos abdominais geralmente podem ser removidos como uma única massa usando fórceps de joalheiro (Roboz, #55) e puxão suave. A remoção dos órgãos internos revela o tubo cardíaco pulsante ainda ligado à cutícula dorsal cercada por corpos gordos.
6. Os corpos de gordura são bastante opacos no microscópio leve, consequentemente é necessário remover um pouco dessa gordura para ver o tubo cardíaco claramente. Isso é feito por uma técnica de lipoaspiração usando capilares de vidro finamente desenhados. Os capilares são feitos usando um puxador de pipeta padrão (por exemplo, Sutter P-97 Pipette Puller) e, em seguida, são inseridos em tubos plásticos (Tygon, 1/16") ligados a uma fonte de vácuo. Este sistema é usado para aspirar o excesso de gordura ao redor do tubo cardíaco. A força de sucção é proporcional ao diâmetro da ponta, de modo que pipetas com pontas maiores que 40 mícrons de diâmetro não devem ser utilizadas. É preciso ter cuidado extremo para evitar tocar o próprio coração e porque a parte posterior do coração é muito frágil essa região deve ser evitada completamente.
7. O tubo cardíaco de Drosophila adulto está exposto e deve estar batendo. Se necessário, a cutícula e o coração preso podem ser reposicionados levantando suavemente a cutícula da geleia de petróleo e cuidadosamente tampá-la de volta para baixo, evitando novamente qualquer contato com o tecido cardíaco. Neste ponto, a solução que banha a preparação deve ser substituída por AHL fresca. Esta preparação deve ser permitida a equilibrar por 20-30 minutos com oxigenação antes de qualquer manipulação. Se a preparação for mantida por mais de 60 minutos, deve ser perfundida com AHL fresca.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Spring Scissors (curved)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5611	Good for gross cuts (Step 2)
Micro Dissecting Spring Scissors (straight)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5620
Dumont #55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11295-10
Glass Capillaries, fine	Science Products	GB100T8P
Pipette Puller	Sutter Equipment	P-97	Both horizontal and vertical pipette pullers will work
Plastic tubing	Tygon	1/16" inner diameter	for 100 µl capillaries
Histoacryl® tissue adhesive	B. Braun Medical