دروسوفيلا اختبار تفضيل وضع البيض: طريقة لاختبار صنع القرار في الذباب

Overview

الإناث Drosophila الاختيار بين الركائز ومواقع مختارة التي هي جذابة لوضع البيض. يصف هذا الفيديو المقايسة السلوكية التي تختبر عملية صنع القرار الخاصة بهم، وتسمى المقايسة تفضيل وضع البيض. يوضح المقطع المميز الإجراء من خلال إعداد مصمم خصيصا ، والذي يمكن الباحثين ليس فقط من اختبار سلوك العديد من الإناث في نفس الوقت ولكنه متوافق أيضا مع تسجيل الفيديو والإعداد البصري.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من غو وآخرون., عالية الإنتاجية المقايسة لفحص تفضيلات البيض زرع الفرد Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).

1. غرفة البناء، الجمعية، الإعداد المقايسة

1. لديك متجر آلة بناء الاكريليك البيض زرع الغرف (الشكل 1A-D). الرسم الهندسي لقطع مختلفة مبين في الشكل التكميلي 1-3. يمكن أيضا العثور على صور عالية الدقة هنا(http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber٪20design.pdf).
2. إدراج الأغطية البلاستيكية في تحميل (أعلى) قطعة من الغرفة كما هو مبين في الشكل 1C. هذا بمثابة السطح السفلي أثناء تحميل الذباب في الساحات الفردية زرع البيض.
3. تخدير الإناث على وسادة CO₂ وتحميلها بشكل فردي في كل ساحة زرع البيض. السماح ~ 30 دقيقة للذباب للتعافي من CO₂ وتصبح متأقلمة مع البيئة الجديدة.
4. إعداد ركائز الآغاروز.
   1. للراحة، احتفظ بزجاجة مسبقة الصنع من الآغاروز الذائب بنسبة 1٪ في حمام مائي 55 درجة مئوية.
   2. إضافة الكمية المطلوبة من محلول السكروز الأسهم (2 M) في أنبوب مخروطي 50 مل وخلطه مع كمية مناسبة من الآغاروز. على سبيل المثال، لإعداد ركيزة السكروز 150 mM، ضع 750 ميكروغرام من محلول السكروز 2 M في الأنبوب ومن ثم ملء الأنبوب مع agarose إلى علامة 10 مل.
   3. إعداد الركيزة عادي بنفس الطريقة ولكن إضافة الماء المقطر بدلا من محلول السكروز.
      ملاحظة: التركيز النهائي لل agarose في هذا البروتوكول هو أقل قليلا من 1٪. في تجربتنا، والتركيز الدقيق للgarose لا يهم طالما أنه يتم التحكم في أن تكون ضمن ~ 0.9 - 1.1٪ وأن الركيزتين هي من نفس تركيز الآغاروز.
5. تأخذ الركيزة (أسفل) قطعة من الغرفة وماصة 1000 ميكرولتر من ركيزة agarose في كل الحوض الصغير كما رأينا في الشكل 1D.
6. السماح للأغاروز لترسيخ ل ~ 30 دقيقة.
7. مرة واحدة في الركائز agarose والذباب جاهزة، وتجميع جميع القطع الثلاث من غرفة وضع البيض ومن ثم إخراج الأغطية البلاستيكية.
8. ضع الغرف في حاضنات الطيران.
   ملاحظة: يمكن أن يختلف طول تجارب وضع البيض اعتمادا على الاحتياجات التجريبية. نحن عادة تشغيل التجربة O / N (14 - 16 ساعة). كما لم يلاحظ أي تأثير كبير للتوقيت الإيقاعي على تفضيلات وضع البيض.
9. تخدير الإناث عن طريق حقن_ثاني أكسيد الكربون في الغرفة. تفكيك الغرفة، والتخلص من الذباب تخدير في المشرحة يطير(أي،يمكن مليئة القهوة فارغة مع بعض زيت الذرة). التقاط صور لنتائج حفظ السجلات (انظر الشكل 2).
10. عد عدد البيض يدويا وحساب مؤشرات تفضيل للتحليل. حساب مؤشر التفضيل على أنه (N_a - N b)/(N_a + N_b)حيث يمثل N_a و N_b عدد البيض في الموقع a مقابل الموقع b، على التوالي.

Representative Results

الشكل 1: غرف وضع البيض وبروتوكول وضع البيض. (أ)البيض تجميعها بالكامل -زرع الغرفة. (ب)قطع مفككة. أ: قطعة التحميل (أعلى)، ب: قطعة المقسم (وسط)، ج: الركيزة (أسفل) قطعة. وتظهر الرسومات الهندسية لهذه القطع في الشكل التكميلي 1-3. (ج)قطعة التحميل من الغرفة. أ': الأبواب المنزلقة، أ": القضبان. يتم إدخال الأغطية البلاستيكية في قطعة التحميل لتكون بمثابة أرضية للحفاظ على الذباب المحمل في مكانه. نحن عادة وضع الأشرطة الملونة على حافة الأغطية البلاستيكية (السهم الأحمر). (د)الركيزة (أسفل) ومقسم (وسط) قطعة من الغرفة. يتم إيداع Agarose في أحواض فردية لتكون بمثابة ركائز زرع البيض (السهام). الخطوط العريضة رباعية الخطوط العريضة للساحة البيض زرع لذبابة واحدة. (ه) اليوم 0 من الإناث / الذكور التي تم جمعها في قارورة الخميرة. (F) اليوم 4 - 5 من الإناث / الذكور التي تم جمعها في قارورة الخميرة. لاحظ أن اليرقات والإناث البالغات قد أكلن معظم الخميرة وأصبح سطح الطعام مشغولا باليرقات. يمنع الطعام السطحي الرطب الزاحف باليرقات الإناث من وضع المزيد من البيض في القارورة. (G) التخطيطي تصور بروتوكول لإعداد تجارب سلوك البيض زرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نتائج وضع البيض التمثيلي للذباب الاختيار بين السكروز والركائز عادي. (أ)عرض جانبي لنتائج وضع البيض من نوع الذباب البري عندما أعطيت لهم الاختيار بين السكروز (150 mM) والركائز العادية. مربع أبيض يحدد ساحة واحدة لوضع البيض لذبابة واحدة. (ب) أعلى عرض لنتائج وضع البيض. مربع أبيض يحدد ساحة واحدة لوضع البيض لذبابة واحدة. (ج)مؤشر الأفضلية (PI) من نوع الذباب البري عندما يطلب منه الاختيار بين الركيزة المحتوية على السكروز والركيزة العادية. يتم حساب PI لكل أنثى على النحو التالي: (عدد البيض على ركيزة السكروز - عدد البيض على الركائز العادية) / العدد الإجمالي للبيض. يشير شريط الخطأ إلى SEM. الرجاء النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: الرسومات الهندسية للمقسم وقطعة الركيزة في الغرفة. (A-A") وجهات نظر مختلفة من قطعة الركيزة من الغرفة. (B-B ') وجهات نظر مختلفة من قطعة المقسم الأوسط من الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: الرسومات الهندسية لقطعة التحميل في الغرفة. (A-A') وجهات نظر مختلفة من الطبقة العليا من قطعة التحميل من الغرفة. (B-B ') وجهات نظر مختلفة من الطبقة السفلى من قطعة التحميل من الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: الرسم الهندسي للباب المنزلق والسكك الحديدية على الغرفة. (أ)السكك الحديدية ثابتة على الجزء العلوي من الغرفة. (ب)الباب المنزلق للغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC