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Encyclopedia of Experiments

Drosophila Egg-Laying Preference Assay: Eine Methode, um Die Entscheidungsfindung bei Fliegen zu testen

Overview

Drosophila-Weibchen wählen zwischen Substraten und ausgewählten Standorten, die für die Eiablage attraktiv sind. Dieses Video beschreibt einen Verhaltenstest, der ihre Entscheidungsfindung testet, den sogenannten Präferenztest für die Eiablage. Der vorgestellte Clip demonstriert das Verfahren mit einem maßgeschneiderten Setup, das es Forschern ermöglicht, nicht nur das Verhalten vieler Frauen gleichzeitig zu testen, sondern auch mit Videoaufzeichnung und optogenetischen Setups kompatibel ist.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).

1. Kammerbau, Montage, Assay-Setup

  1. Lassen Sie eine Maschinenhalle Acryl-Ei-Verlegekammern bauen (Abbildung 1A-D). Die konstruktionstechnische Zeichnung verschiedener Stücke wurde in der Zusatzabbildung 1-3dargestellt. Hochauflösende Bilder finden Sie auch hier (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
  2. Setzen Sie Kunststoffplatten in das Ladestück (oben) der Kammer ein, wie in Abbildung 1Cdargestellt. Dies dient als Bodenfläche, während das Laden in einzelne Eilegearenen fließt.
  3. Anästhetisieren Sie Weibchen auf einem CO2-Pad und laden Sie sie einzeln in jede Eilegearena. Lassen Sie 30 min für Fliegen von der CO2 erholen und sich an die neue Umgebung zu akklimatisieren.
  4. Bereiten Sie die Agarose-Substrate vor.
    1. Bewahren Sie eine vorgefertigte Flasche geschmolzener 1% Agarose in einem 55 °C Wasserbad auf.
    2. Die gewünschte Menge an Saccharoselösung (2 M) in ein 50 ml konisches Rohr geben und mit der entsprechenden Menge Anarose mischen. Zum Beispiel, um das 150 mM Saccharosesubstrat vorzubereiten, 750 l von 2 M Saccharoselösung in das Rohr geben und dann das Rohr mit Agarose auf die 10 ml-Marke füllen.
    3. Bereiten Sie das einfache Substrat auf die gleiche Weise vor, fügen Sie aber destilliertes Wasser anstelle von Saccharoselösung hinzu.
      HINWEIS: Die endgültige Konzentration von Agarose in diesem Protokoll beträgt etwas weniger als 1%. Unserer Erfahrung nach spielt die genaue Konzentration von Agarose keine Rolle, solange sie kontrolliert wird, um innerhalb von 0,9 - 1,1 % zu liegen, und dass die beiden Substrate die gleiche Agarosekonzentration aufweisen.
  5. Nehmen Sie das Substrat (unteres) Stück der Kammer und die Pipette 1.000 l Agarosesubstrat in jeden Trog, wie in Abbildung 1Ddargestellt.
  6. Lassen Sie Agarose für 30 min erstarren.
  7. Sobald die AgaroseSubstrate und Fliegen fertig sind, alle drei Teile der Eiablagekammer zusammenbauen und dann die Kunststoffplatten herausnehmen.
  8. Legen Sie die Kammern in Fliegeninkubatoren.
    HINWEIS: Die Dauer der Eierlegeexperimente kann je nach experimentellem Bedarf variieren. Normalerweise führen wir das Experiment O/N (14 - 16 Std.) durch. Auch wurden keine signifikanten Auswirkungen des zirkadianen Timings auf die Präferenzen für das Eierlegen beobachtet.
  9. Anästhesisieren Sie Weibchen, indem Sie CO2 in die Kammer injizieren. Zerlegen Sie die Kammer, entsorgen Sie die anästhesierten Fliegen in die Leichenhalle(d.h.eine leere Kaffeedose, die mit etwas Maisöl gefüllt ist). Nehmen Sie Fotos von den Ergebnissen für die Aufzeichnung (siehe Abbildung 2).
  10. Zählen Sie die Anzahl der Eier manuell und berechnen Sie Präferenzindizes für die Analyse. Berechnen Sie den Präferenzindex als (Na - Nb)/(Na + Nb), wobei Na und Nb die Anzahl der Eier vor Ort a vs. Standort b darstellen.

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Representative Results

Figure 1
Abbildung 1: Eierlegekammern und Eierlegeprotokoll. (A) Voll montierte Ei-Laying-Kammer. (B) Zerlegte Teile. a: das Ladestück (oben), b: das Teilerstück (Mitte), c: das Substrat (unten) Stück. Die Konstruktionszeichnungen dieser Arbeiten sind in der Ergänzenden Abbildung 1-3dargestellt. (C) Das Ladestück der Kammer. a': Schiebetüren, a": Schienen. Die Kunststoffplatten werden in das Ladestück eingesetzt, um als Boden zu dienen, um die beladenen Fliegen an Ort und Stelle zu halten. Normalerweise legen wir Farbbänder auf den Rand der Kunststoffplatten (roter Pfeil). (D) Das Substrat (unten) und die Trennteile (Mitte) der Kammer. Agarose wird in einzelnen Trögen abgelagert, um als Eilegendersubstrate (Pfeile) zu dienen. Viereckig umreißt die Eilegende Arena für eine einzige Fliege. (E) Tag 0 der gesammelten Weibchen/Männchen in einer Hefedurchstechflasche. (F) Tag 4 - 5 der gesammelten Weibchen/Männchen in einer Hefedurchstechflasche. Beachten Sie, dass Larven und erwachsene Weibchen den größten Teil der Hefe gegessen haben und die Oberfläche der Nahrung von Larven besetzt wurde. Die nassen Oberflächennahrung, die mit Larven kriecht, verhindert, dass Weibchen mehr Eier in die Durchstechflasche legen. (G) Schematische Darstellung des Protokolls zur Einrichtung von Verhaltensexperimenten für das Eierlegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der Eierverlegung für Fliegen bei der Wahl zwischen Saccharose und einfachen Substraten. (A) Seitenansicht der Eiablageergebnisse von Wildfliegen, wenn sie zwischen Saccharose (150 mM) und einfachen Substraten wählen konnten. Weiße Box umreißt eine Ei-Laying-Arena für eine einzelne Fliege. (B) Obere Ansicht der Ergebnisse der Eiablage. Weiße Box umreißt eine Ei-Laying-Arena für eine einzelne Fliege. (C) Präferenzindex (PI) des wilden Typs fliegt, wenn er gebeten wird, zwischen einem saccharosehaltigen Substrat und einem einfachen Substrat zu wählen. PI für jedes Weibchen wird wie folgt berechnet: (Anzahl der Eier auf Saccharosesubstrat - Anzahl der Eier auf den einfachen Substraten)/Gesamtanzahl der Eier. Fehlerleiste zeigt SEM an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 1
Ergänzende Abbildung 1: Konstruktionszeichnungen für den Teiler und das Substratstück der Kammer. (A-A") Unterschiedliche Ansichten des Substratstücks der Kammer. (B-B') Unterschiedliche Ansichten des mittleren Teilerstücks der Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 2
Ergänzende Abbildung 2: Konstruktionszeichnungen für das Ladestück der Kammer. (A-A') Unterschiedliche Ansichten der oberen Schicht des Ladestücks der Kammer. (B-B') Unterschiedliche Ansichten der unteren Schicht des Ladestücks der Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 3
Ergänzende Abbildung 3: Konstruktionszeichnung für die Schiebetür und die Schiene auf der Kammer. (A) Die Schiene, die auf dem oberen Teil der Kammer befestigt ist. (B) Die Schiebetür für die Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-500
Sucrose Sigma S0389
Water bath Fisher 15-462-6Q
Egg-laying chambers Custom Built
Fly vials (narrow) Genesee 32-116BC

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