דרוזופילה (לא כולל) העדפת הטלת ביצים: שיטה לבדיקת קבלת החלטות בזבובים

Overview

נקבות דרוזופילה בוחרות בין מצעים לבין אתרים נבחרים אטרקטיביים להטלת ביצים. סרטון זה מתאר בדיקה התנהגותית הבדוקה את קבלת ההחלטות שלהם, הנקראת בדיקת העדפת הטלת הביצים. הסרטון המוצג מדגים את ההליך עם התקנה שנבנתה בהתאמה אישית, המאפשרת לחוקרים לא רק לבחון את התנהגותן של נקבות רבות בו זמנית, אלא גם תואמת להקלטת וידאו והגדרות אופטוגנטיות.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Gou et al., תפוקה גבוהה Assay לבחון העדפות הטלת ביצים של drosophila מלנוגאסטר בודדים, J. Vis. Exp. (2016).

1. בנייה קאמרית, הרכבה, התקנת מבחני

1. יש חנות מכונות לבנות תאי הטלת ביצים אקריליים(איור 1A-D). הציור ההנדסי של יצירות שונות הוצג באיור המשלים 1.3. ניתן למצוא כאן גם תמונות ברזולוציה גבוהה (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. הכנס יריעות פלסטיק לתוך חתיכת טעינה (למעלה) של התא כפי שמוצג באיור 1C. זה משמש כמשטח התחתון תוך העמסת זבובים לזירות מטילות ביצים בודדות.
3. הרדמה נקבות על כרית CO₂ ולהעמיס אותם בנפרד לתוך כל זירת הטלת ביצה. אפשר ~ 30 דקות עבור זבובים להתאושש מן CO₂ ולהתאקלם לסביבה החדשה.
4. הכינו את מצעי ההתעוררות.
   1. לנוחותכם, שמרו על בקבוק מומס של 1% אגרוז באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס.
   2. מוסיפים את הכמות הרצויה של פתרון סוכרוז מלאי (2 M) לתוך צינור חרוט 50 מ"ל ומערבבים אותו עם כמות מתאימה של agarose. לדוגמה, כדי להכין את מצע סוכרוז 150 mM, מקום 750 μl של 2 M פתרון סוכרוז לתוך הצינור ולאחר מכן למלא את הצינור עם agarose לסימן 10 מ"ל.
   3. הכינו את המצע הפשוט באותו אופן אך הוסיפו מים מזוקקים במקום תמיסת סוכרוז.
      שים לב: הריכוז הסופי של agarose בפרוטוקול זה הוא קצת פחות מ 1%. מניסיוננו, הריכוז המדויק של agarose לא משנה כל עוד הוא נשלט להיות בתוך ~ 0.9 - 1.1% וכי שני המצעים הם מאותו ריכוז agarose.
5. קחו את חתיכת המצע (התחתונה) של התא ואת פיפטה 1,000 מיקרומטר של מצע אגרוז לתוך כל שוקת כפי שניתן לראות באיור 1D.
6. אפשר agarose להתמצק במשך ~ 30 דקות.
7. לאחר מצעים agarose וזבובים מוכנים, להרכיב את כל שלוש חתיכות של תא הטלת ביצה ולאחר מכן להוציא את יריעות פלסטיק.
8. מניחים את התאים באינקובטורים מעופפים.
   שים לב: אורך הניסויים בהטלת ביצים יכול להשתנות בהתאם לצרכים הניסיוניים. אנחנו בדרך כלל להפעיל את הניסוי O / N (14 - 16 שעות). כמו כן, לא נצפתה השפעה משמעותית של תזמון צירקדי על העדפות הטלת ביצים.
9. המרדים נקבות על ידי הזרקת CO₂ לתוך התא. לפרק את התא, להשליך את זבובים מורדמים לתוך חדר המתים זבוב(כלומר,קפה ריק יכול מלא קצת שמן תירס). צלם את התוצאות לצורך רישום רשומות (ראה איור 2).
10. ספור את מספר הביצים באופן ידני וחשב מדדי העדפות לניתוח. חשב אינדקס העדפות כ( N_a - N_b)/(N_a + N_b) כאשר N_a ו- N_b מייצגים את מספר הביצים באתר לעומת אתר b, בהתאמה.

Representative Results

איור 1: תאי הטלת ביצים ופרוטוקול הטלת ביצים. (A)תא הטלת ביצים בהרכבה מלאה. (B)חתיכות מפורקות. a: חתיכת הטעינה (למעלה), b: חתיכת הקו המפריד (האמצעי), ג: חתיכת המצע (התחתונה). ציורים הנדסיים של יצירות אלה מוצגים באיור המשלים 1.3. (ג)חתיכת הטעינה של התא. א': דלתות הזזה, א": מסילות. יריעות הפלסטיק מוכנסות לחתיכת הטעינה כדי לשמש כקומה כדי לשמור על הזבובים הטעונים במקומם. בדרך כלל שמנו קלטות צבע על קצה יריעות הפלסטיק (חץ אדום). (ד)המצע (למטה) והחוצץ (האמצעי) חתיכות של התא. אגרוז מופקד לתוך שוקת בודדת כדי לשמש מצעים מטילי ביצים (חצים). מרובע מתאר את זירת הטלת הביצים עבור זבוב אחד. (ה)יום 0 של נקבות /זכרים שנאספו בבקבוקון שמרים. (ו)יום 4 - 5 של נקבות / זכרים שנאספו בבקבוקון שמרים. שים לב כי זחלים ונקבות בוגרות אכלו את רוב השמרים ואת פני השטח של המזון הפך כבוש על ידי זחלים. מזון פני השטח הרטובים הזוחלים בזחלים מונע מהנקבות להטיל יותר ביצים על הבקבוקון. (G) סכמטי המתאר את הפרוטוקול להגדרת ניסויי התנהגות מטילי ביצים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תוצאות הטלת ביצים מייצגות עבור זבובים הבוחרים בין סוכרוז למצעים רגילים. (A)תצוגה צדדית של תוצאות הטלת ביצים של זבובים מסוג בר כאשר ניתנה להם בחירה בין סוכרוז (150 מ"מ) לבין מצעים רגילים. קופסה לבנה מתארת זירת הטלת ביצים אחת לטיסה אחת. (B)תצוגה עליונה של תוצאות הטלת ביצים. קופסה לבנה מתארת זירת הטלת ביצים אחת לטיסה אחת. (C) אינדקס העדפה (PI) של זבובים מסוג בר כאשר הם מתבקשים לבחור בין מצע המכיל סוכרוז לבין מצע רגיל. PI עבור כל נקבה מחושב כדלקמן: (מספר הביצים על מצע סוכרוז - מספר הביצים על מצעים רגילים)/ המספר הכולל של ביצים. סרגל השגיאות מציין SEM. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: שרטוטים הנדסיים עבור הקו המפריד ופיסת המצע של הלשכה. (A-A") תצוגות שונות של פיסת המצע של התא. (B-B') תצוגות שונות של פיסת המפריד האמצעי של התא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 2: שרטוטים הנדסיים לפיסת הטעינה של הלשכה. (A-A') תצוגות שונות של השכבה העליונה של חתיכת הטעינה של התא. (B-B') תצוגות שונות של השכבה התחתונה של חתיכת הטעינה של התא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 3: רישום הנדסי לדלת ההזזה ולמעקה בתא. (A)המעקה קבוע על החלק העליון של התא. (B)דלת ההזזה לתא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC