ड्रोसोफिला अंडा बिछाने वरीयता परख: मक्खियों में निर्णय लेने का परीक्षण करने के लिए एक विधि

Overview

ड्रोसोफिला मादाएं सब्सट्रेट्स और चुनिंदा साइटों के बीच चुनती हैं जो अंडे बिछाने के लिए आकर्षक हैं। इस वीडियो में एक व्यवहार परख का वर्णन है कि उनके निर्णय लेने का परीक्षण, अंडा बिछाने वरीयता परख कहा जाता है । विशेष रुप से प्रदर्शित क्लिप एक कस्टम निर्मित सेटअप के साथ प्रक्रिया को दर्शाता है, जो शोधकर्ताओं को न केवल एक ही समय में कई महिलाओं के व्यवहार का परीक्षण करने में सक्षम बनाता है बल्कि वीडियो रिकॉर्डिंग और ऑप्टोजेनेटिक सेटअप के साथ भी संगत है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल गोलू एट अल., उच्च थ्रूपुट परख से एक अंश है जो व्यक्तिगत ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर,जे विस एक्सप्रेस की अंडा-बिछाने वरीयताओं की जांच करने के लिएहै। (2016). 

1. चैंबर निर्माण, विधानसभा, परख सेटअप

1. एक मशीन की दुकान एक्रेलिक अंडा बिछाने कक्षों(चित्रा 1ए-डी)का निर्माण करें । विभिन्न टुकड़ों की इंजीनियरिंग ड्राइंग को अनुपूरक चित्र 1-3में दिखाया गया था । उच्च संकल्प चित्र भी यहां पाया जा सकताहै (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf)।
2. चित्रा 1सीमें दिखाया गया है के रूप में चैंबर के लोडिंग (ऊपर) टुकड़ा में प्लास्टिक शीट डालें । यह नीचे की सतह के रूप में कार्य करता है, जबकि अलग-अलग अंडे बिछाने वाले एरेनास में मक्खियों को लोड करता है।
3. एक सीओ₂ पैड पर महिलाओं को एनेस्थेटाइज करें और उन्हें प्रत्येक अंडे बिछाने वाले क्षेत्र में व्यक्तिगत रूप से लोड करें। मक्खियों के लिए ~ 30 मिनट की अनुमति दें सीओ₂ से उबरने के लिए और नए वातावरण के लिए आदत हो जाते हैं।
4. एगरेब्रास सब्सट्रेट्स तैयार करें।
   1. सुविधा के लिए, पिघला हुआ 1% की एक प्रीमेड बोतल 55 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखें।
   2. स्टॉक सुक्रोज समाधान (2 एम) की वांछित मात्रा को 50 मिलीलीटर शंकु नली में जोड़ें और इसे उचित मात्रा में एगर उठे के साथ मिलाएं। उदाहरण के लिए, 150 m m सुक्रोज सब्सट्रेट तैयार करने के लिए, ट्यूब में 2 एम सुक्रोज समाधान के 750 माइक्रोन रखें और फिर ट्यूब को 10 मिलीलीटर के निशान पर एग्राम के साथ भरें।
   3. सादे सब्सट्रेट को उसी तरीके से तैयार करें लेकिन सुक्रोज सॉल्यूशन के बजाय आसुत पानी डालें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में एगर उठे की अंतिम एकाग्रता 1% से थोड़ी कम है। हमारे अनुभव में, एगरॉंग की सटीक एकाग्रता तब तक मायने नहीं रखती है जब तक कि इसे ~ 0.9 - 1.1% के भीतर नियंत्रित किया जाता है और दो सब्सट्रेट्स एक ही उत्पींग एकाग्रता के होते हैं।
5. कक्ष के सब्सट्रेट (नीचे) टुकड़े को लें और प्रत्येक गर्त में 1,000 माइक्रोन के पिपेट सब्सट्रेट लें जैसा कि चित्र 1डीमें देखा गया है।
6. अगेन को ~ 30 मिनट के लिए जमना चाहिए।
7. एक बार जब एगर उठे सब्सट्रेट्स और मक्खियां तैयार हो जाती हैं, तो अंडे बिछाने वाले कक्ष के सभी तीन टुकड़ों को इकट्ठा करें और फिर प्लास्टिक की चादरें निकाल लें।
8. फ्लाई इनक्यूबेटर में कक्षों को रखें।
   नोट: अंडे बिछाने के प्रयोगों की लंबाई प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर भिन्न हो सकती है। हम आम तौर पर प्रयोग O/N (14-16 घंटे) चलाते हैं । इसके अलावा, अंडे बिछाने वरीयताओं पर सर्कैडियन समय का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं देखा गया था।
9. कक्ष में सीओ₂ इंजेक्शन लगाकर महिलाओं को एनेस्थेटाइज करें। कक्ष को अलग करें, एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों को फ्लाई मुर्दाघर में त्यागें(यानी,एक खाली कॉफी कुछ मकई के तेल से भर सकती है)। रिकॉर्डकीपिंग के लिए परिणामों की तस्वीरें लें (चित्रा 2देखें)।
10. अंडे की संख्या को मैन्युअल रूप से गिनें और विश्लेषण के लिए वरीयता सूचकांकों की गणना करें। वरीयता सूचकांक की गणना करें (एन_ए-एन बी)/(एन_ए + एन_बी)जहां एन_ए और एन_बी साइट पर क्रमशः एक बनाम साइट बी पर अंडों की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Representative Results

चित्रा 1: अंडा बिछाने कक्षों और अंडा बिछाने प्रोटोकॉल । (A)पूरी तरह से इकट्ठे अंडे बिछाने वाला कक्ष । (ख)अलग टुकड़े । ए: लोडिंग टुकड़ा (ऊपर), बी: डिवाइडर टुकड़ा (मध्य), सी: सब्सट्रेट (नीचे) टुकड़ा। इन टुकड़ों के इंजीनियरिंग चित्र पूरक चित्र 1-3में दिखाए गए हैं । (ग)चैंबर का लोडिंग पीस । एक': स्लाइडिंग दरवाजे, एक ": रेल। लोडेड मक्खियों को जगह में रखने के लिए एक मंजिल के रूप में सेवा करने के लिए प्लास्टिक शीट लोडिंग टुकड़े में डाली जाती हैं। हम आम तौर पर प्लास्टिक शीट (लाल तीर) के किनारे पर रंग टेप डाल दिया। (घ)सब्सट्रेट (नीचे) और डिवाइडर (मध्य) कक्ष के टुकड़े। एगर उठे को अंडे बिछाने वाले सब्सट्रेट्स (तीर) के रूप में काम करने के लिए अलग-अलग गर्त में जमा किया जाता है। चतुर्भुज एक ही मक्खी के लिए अंडा बिछाने के अखाड़े की रूपरेखा तैयार करता है । (ई)एक खमीर शीशी में एकत्र महिलाओं/पुरुषों का दिन 0 । (F)एक खमीर शीशी में एकत्र महिलाओं/पुरुषों के दिन 4 । ध्यान दें कि लार्वा और वयस्क महिलाओं ने अधिकांश खमीर खाया है और भोजन की सतह लार्वा द्वारा कब्जा कर ली गई है। लार्वा के साथ रेंगने वाला गीला सतह भोजन महिलाओं को शीशी में अधिक अंडे डालने से रोकता है। (जी)योजनाबद्ध अंडा बिछाने व्यवहार प्रयोगों की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल का चित्रण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: सुक्रोज और सादे सब्सट्रेट्स के बीच चुनने वाली मक्खियों के लिए प्रतिनिधि अंडा-बिछाने के परिणाम। (A)जंगली प्रकार की मक्खियों के अंडे बिछाने के परिणामों का साइड व्यू जब उन्हें सुक्रोज (150 mm) और सादे सब्सट्रेट्स के बीच विकल्प दिया गया था। सफेद बॉक्स एक ही मक्खी के लिए एक अंडा बिछाने के क्षेत्र की रूपरेखा । (ख)अंडा बिछाने के परिणामों का शीर्ष दृश्य । सफेद बॉक्स एक ही मक्खी के लिए एक अंडा बिछाने के क्षेत्र की रूपरेखा । (ग)जंगली प्रकार के वरीयता सूचकांक (पीआई) को सुक्रोज युक्त सब्सट्रेट और एक सादे सब्सट्रेट के बीच चयन करने के लिए कहा जाता है। प्रत्येक महिला के लिए पीआई की गणना इस प्रकार की जाती है: (सुक्रोज सब्सट्रेट पर अंडों की संख्या - सादे सब्सट्रेट्स पर अंडों की संख्या)/अंडों की कुल संख्या। त्रुटि बार SEM इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 1: डिवाइडर के लिए इंजीनियरिंग चित्र और चैंबर के सब्सट्रेट टुकड़ा। (ए-ए" कक्ष के सब्सट्रेट टुकड़े के विभिन्न दृश्य। (बी-बी') चैंबर के बीच डिवाइडर टुकड़ा के विभिन्न दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: चैंबर के लोडिंग पीस के लिए इंजीनियरिंग चित्र। (ए-ए) कक्ष के लोडिंग टुकड़े की ऊपरी परत के विभिन्न दृश्य। (बी-बी') कक्ष के लोडिंग टुकड़े की निचली परत के विभिन्न दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 3: स्लाइडिंग डोर और चैंबर पर रेल के लिए इंजीनियरिंग ड्राइंग । (क)रेल कक्ष के शीर्ष टुकड़े पर तय की गई । (ख)चैंबर के लिए स्लाइडिंग डोर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC