Drosofilia Test di preferenza per la deposizione delle uova: un metodo per testare il processo decisionale nelle mosche

Overview

Le femmine di Drosophila scelgono tra substrati e siti selezionati che sono attraenti per la deposizione delle uova. Questo video descrive un saggio comportamentale che testa il loro processo decisionale, chiamato test delle preferenze di deposizione delle uova. La clip in primo piano dimostra la procedura con una configurazione personalizzata, che consente ai ricercatori non solo di testare il comportamento di molte femmine allo stesso tempo, ma è anche compatibile con la registrazione video e le configurazioni optogenetiche.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).

1. Costruzione della camera, assemblaggio, impostazione del saggio

1. Fare in modo che un'officina costruisci camere acriliche per la deposizione delleuova (figura 1A-D). Il disegno ingegneristico di pezzi diversi è stato mostrato nella figura complementare 1-3. Le immagini ad alta risoluzione sono disponibili anche qui (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. Inserire fogli di plastica nel pezzo di carico (superiore) della camera, come illustrato nella figura 1C. Questo funge da superficie inferiore durante il caricamento delle mosche nelle singole arene di deposizione delle uova.
3. Anestetizza le femmine su un cuscinetto di CO₂ e caricale individualmente in ogni arena di deposizione delle uova. Lasciare ~30 minuti per le mosche per recuperare dalla CO₂ e per abituarsi al nuovo ambiente.
4. Preparare i substrati di agarosio.
   1. Per comodità, conservare una bottiglia prefabbturata di agarosio fuso all'1% in un bagno d'acqua a 55 °C.
   2. Aggiungere la quantità desiderata di soluzione di saccarosio stock (2 M) in un tubo conico da 50 ml e mescolarla con una quantità appropriata di agarosio. Ad esempio, per preparare il substrato di saccarosio da 150 mM, posizionare 750 μl di soluzione di saccarosio da 2 M nel tubo e quindi riempire il tubo con agarosio al segno da 10 ml.
   3. Preparare il substrato semplice allo stesso modo ma aggiungere acqua distillata invece della soluzione di saccarosio.
      NOTA: La concentrazione finale di agarosio in questo protocollo è leggermente inferiore all'1%. Nella nostra esperienza, l'esatta concentrazione di agarosio non ha importanza finché è controllata per essere entro ~ 0,9 - 1,1% e che i due substrati sono della stessa concentrazione di agarosio.
5. Prendere il pezzo di substrato (in basso) della camera e pipettare 1.000 μl di substrato di agarosio in ogni trogolo come si vede nella figura 1D.
6. Lasciare solidificare l'agarosio per ~ 30 minuti.
7. Una volta che i substrati e le mosche dell'agarosio sono pronti, assemblare tutti e tre i pezzi della camera di deposizione delle uova e quindi estrarli.
8. Posizionare le camere in incubatori di mosca.
   NOTA: La durata degli esperimenti di deposizione delle uova può variare a seconda delle esigenze sperimentali. In genere eseguiamo l'esperimento O/N (14 - 16 ore). Inoltre, non è stato osservato alcun impatto significativo dei tempi circadiani sulle preferenze di deposizione delle uova.
9. Anestetizzare le femmine iniettando CO₂ nella camera. Smontare la camera, scartare le mosche anestetizzatenell'obitorio di mosca (cioè, una lattinedi caffè vuota piena di olio di mais). Scattare foto dei risultati per la registrazione (vedere la figura 2).
10. Contare manualmente il numero di uova e calcolare gli indici di preferenza per l'analisi. Calcolare l'indice di preferenza come (N_a - N_b)/(N_a + N_b) dove N_a e N_{b rappresentano} rispettivamente il numero di uova sul sito a rispetto al sito b.

Representative Results

Figura 1: Camere di deposizione delle uova e protocollo di deposizione delle uova. (A) Camera di deposizione delle uova completamente assemblata. (B) Pezzi smontati. a: il pezzo di carico (in alto), b: il pezzo divisore (al centro), c: il pezzo del substrato (in basso). I disegni ingegneristici di questi pezzi sono riportati nella figura complementare 1-3. (C)Il pezzo di carico della camera. a': porte scorrevoli, a": rotaie. I fogli di plastica vengono inseriti nel pezzo di carico per fungere da pavimento per mantenere le mosche caricate in posizione. In genere mettiamo nastri di colore sul bordo dei fogli di plastica (freccia rossa). (D) Il substrato (in basso) e i pezzi divisori (centrali) della camera. L'agarosio viene depositato in singoli trogoli per servire come substrati di deposizione delle uova (frecce). Quadrilatero delinea l'arena di deposizione delle uova per una singola mosca. (E) Giorno 0 delle femmine/maschi raccolti in una fiala lievitata. (F) Giorno 4 - 5 delle femmine/maschi raccolti in una fiala lievitata. Si noti che larve e femmine adulte hanno mangiato la maggior parte del lievito e la superficie del cibo è stata occupata dalle larve. Il cibo superficiale umido che striscia con le larve impedisce alle femmine di deporre più uova nel flaconcino. (G) Schema che descrive il protocollo per l'impostazione di esperimenti sul comportamento di deposizione delle uova. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati rappresentativi della deposizione delle uova per le mosche Scelta tra saccarosio e substrati semplici. (A) Visione laterale dei risultati della deposizione delle uova delle mosche di tipo selvatico quando è stata loro data la possibilità di scegliere tra saccarosio (150 mM) e substrati semplici. La scatola bianca delinea un'arena di deposizione delle uova per una singola mosca. (B) Vista dall'alto dei risultati della deposizione delle uova. La scatola bianca delinea un'arena di deposizione delle uova per una singola mosca. (C) Indice di preferenza (PI) di mosche di tipo selvatico quando viene chiesto di scegliere tra un substrato contenente saccarosio e un substrato semplice. Pi per ogni femmina è calcolato come segue: (numero di uova su substrato di saccarosio - numero di uova sui substrati semplici)/numero totale di uova. La barra degli errori indica SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Disegni ingegneristici per il divisore e il pezzo di substrato della camera. (A-A") Diverse viste del pezzo di substrato della camera. (B-B') Diverse viste del pezzo divisore centrale della camera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura complementare 2: Disegni ingegneristici per il pezzo di carico della camera. (A-A') Diverse viste dello strato superiore del pezzo di carico della camera. (B-B') Diverse viste dello strato inferiore del pezzo di carico della camera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura complementare 3: Disegno ingegneristico per la porta scorrevole e la rotaia sulla camera. (A) Il binario fissato sul pezzo superiore della camera. (B)La porta scorrevole per la camera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC