Дрозофила Яйцо-Укладка Предпочтение Анализ: Метод для проверки принятия решений в мухах

Overview

Drosophila женщины выбирают между субстратами и выбрать сайты, которые являются привлекательными для яйцекладки. Это видео описывает поведенческий анализ, который проверяет их принятия решений, называется яйцекладки предпочтения анализа. Рекомендуемый клип демонстрирует процедуру с специально построенной установкой, которая позволяет исследователям не только проверить поведение многих женщин в то же время, но также совместима с видеозаписи и оптогенетических установок.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Гоу и др.,Высокая пропускная способность анализа для изучения яйцекладка Предпочтения отдельных Drosophila меланогастер, J. Vis. Exp. (2016).

1. Камерная конструкция, сборка, установка анализа

1. Иметь машинный цех построить акриловые яйцекладки камер (Рисунок 1A-D). Инженерный рисунок различных частей был показан на дополнительном рисунке 1-3. Фотографии с высоким разрешением также можнонайти здесь (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. Вставьте пластиковые листы в погрузочный (верхний) кусок камеры, как показано на рисунке 1C. Это служит в качестве нижней поверхности при загрузке летит в отдельных яйцекладка аренах.
3. Обезболивать самок на площадке CO₂ и загружать их индивидуально в каждой яйцекладке арене. Разрешить 30 мин для мух, чтобы оправиться от CO_{2 и} акклиматизироваться к новой среде.
4. Подготовь субстраты агарозы.
   1. Для удобства держите в водяной бане 55 градусов по Цельсию преддельную бутылку расплавленной 1% агарозы.
   2. Добавьте нужное количество раствора сахарозы (2 М) в коническую трубку 50 мл и смешайте ее с соответствующим количеством агарозы. Например, чтобы подготовить субстрат сахарозы 150 мМ, поместите 750 мкл раствора 2 М сахарозы в трубку, а затем заполните трубку агарозой до отметки 10 мл.
   3. Приготовьте простой субстрат таким же образом, но добавьте дистиллированную воду вместо раствора сахарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация агарозы в этом протоколе составляет чуть менее 1%. По нашему опыту, точная концентрация агарозы не имеет значения до тех пор, пока она контролируется в пределах 0,9 - 1,1% и что два субстрата имеют одинаковую концентрацию агарозы.
5. Возьмите субстрат (внизу) кусок камеры и пипетку 1000 мкл субстрата агарозы в каждом корыте, как видно на рисунке 1D.
6. Разрешить агарозы затвердеть в течение 30 мин.
7. После того, как агарозы субстраты и мухи готовы, собрать все три части яйцекладки камеры, а затем вынул пластиковые листы.
8. Поместите камеры в летать инкубаторов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность экспериментов по яйцекладки может варьироваться в зависимости от экспериментальных потребностей. Обычно мы запускаем эксперимент O/N (14 - 16 часов). Кроме того, не было отмечено существенного влияния циркадных сроков на предпочтения в отношении яйцекладки.
9. Обезболивать самок путем введения CO₂ в камеру. Разобрать камеру, выбросить обезболенные мухи в морг мухи(т.е.пустой кофе может заполнить с некоторыми кукурузного масла). Сфот фотографируете результаты для ведения учета (см. рисунок 2).
10. Подсчитайте количество яиц вручную и рассчитайте индексы предпочтений для анализа. Рассчитайте индекс предпочтений как (N_a - N b)/(N_a n_b),где N_a и N_b представляют количество яиц на сайте a против сайта b, соответственно.

Representative Results

Рисунок 1: Яйцекладные камеры и протокол укладки яиц. (A)Полностью собранная камера для укладки яиц. (B)Разобранные куски. а: погрузочный кусок (вверху), б: кусок разделизера (средний), c: субстрат (внизу) кусок. Инженерные чертежи этих произведений показаны на дополнительном рисунке 1-3. (C)Погрузочная часть камеры. a': раздвижные двери, a": рельсы. Пластиковые листы вставляются в погрузочный кусок, чтобы служить в качестве пола, чтобы держать загруженных мух на месте. Обычно мы ставим цветные ленты на край пластиковых листов (красная стрелка). (D)Субстрат (внизу) и разделитель (средний) части камеры. Агароза откладывается в отдельные желоба, чтобы служить в качестве яйцекладки субстратов (стрелки). Четырехсторонний очертания яйцекладки арене для одной мухи. (E)День 0 собранных самок/самцов в дрожжевом флаконе. (F) День 4 - 5 собранных самок / самцов в дрожжевой флакон. Обратите внимание, что личинки и взрослые самки съели большую часть дрожжей и поверхность пищи стала занята личинками. Влажная поверхностная пища, ползаемая личинками, не позволяет самкам откладывать больше яиц во флаконе. (G)Схема, изображающая протокол для создания экспериментов по яйцекладки поведения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Репрезентативные результаты яйцекладки для мух, выбирающих между сахарозой и равнинными субстратами. (A) Боковой вид яйцекладки результаты диких мух типа, когда они получили выбор между сахарозой (150 мМ) и простой субстратов. Белая коробка очерчивает одну яйцекладку арены для одной мухи. (B)Верхний вид результатов яйцекладки. Белая коробка очерчивает одну яйцекладку арены для одной мухи. (C)Индекс предпочтений (PI) мух дикого типа, когда его просят выбрать между сахарозосодержащей субстратом и простым субстратом. PI для каждой самки рассчитывается следующим образом: (количество яиц на субстрате сахарозы - количество яиц на равнинных субстратах)/общее количество яиц. Бар ошибок указывает SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 1: Инженерные чертежи для разделило и субстрат кусок камеры. (A-A)) Различные виды субстрата кусок камеры. (B-B') Различные виды среднего разделизера кусок камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 2: Инженерные чертежи для загрузки части камеры. (A-A') Различные виды верхнего слоя погрузочного куска камеры. (B-B') Различные виды нижнего слоя погрузочной части камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 3: Инженерный рисунок для раздвижной двери и железной дороги на камере. (A)рельс крепится к верхней части камеры. (B)Раздвижная дверь для камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC