Drosophila Ensayo de preferencia de puesta de huevos: un método para probar la toma de decisiones en moscas

Overview

Las hembras de Drosophila eligen entre sustratos y sitios selectos que son atractivos para la puesta de huevos. Este video describe un ensayo conductual que prueba su toma de decisiones, llamado ensayo de preferencia de puesta de huevos. El clip destacado demuestra el procedimiento con una configuración hecha a medida, que permite a los investigadores no sólo probar el comportamiento de muchas hembras al mismo tiempo, sino que también es compatible con la grabación de vídeo y configuraciones optogenéticas.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Gou et al., Ensayo de alto rendimiento para examinar las preferencias de colocación de huevos de Drosophila melanogaster individual, J. Vis. Exp. (2016).

1. Construcción de cámara, Asamblea, Configuración de ensayos

1. Tener una tienda de máquinas construir cámaras acrílicas de puesta de huevos (Figura 1A-D). El dibujo de ingeniería de diferentes piezas se mostró en la Figura Complementaria 1-3. Fotos de alta resolución también se pueden encontrar aquí(http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. Inserte láminas de plástico en la pieza de carga (superior) de la cámara como se muestra en la Figura 1C. Esto sirve como la superficie inferior mientras carga moscas en arenas individuales de puesta de huevos.
3. Anestesista hembras en una almohadilla de CO₂ y cárguelas individualmente en cada arena de puesta de huevos. Deje ~30 min para que las moscas se recuperen del CO₂ y se aclimatan al nuevo entorno.
4. Prepare los sustratos de la agarose.
   1. Para mayor comodidad, mantenga una botella prefabricada de 1% desrretido en un baño de agua de 55 °C.
   2. Añadir la cantidad deseada de solución de sacarosa de stock (2 M) en un tubo cónico de 50 ml y mezclarlo con la cantidad adecuada de agarose. Por ejemplo, para preparar el sustrato de sacarosa de 150 mM, coloque 750 μl de solución de sacarosa de 2 M en el tubo y luego llene el tubo con agarose a la marca de 10 ml.
   3. Prepare el sustrato liso de la misma manera, pero agregue agua destilada en lugar de solución de sacarosa.
      NOTA: La concentración final de agarose en este protocolo es ligeramente inferior al 1%. En nuestra experiencia, la concentración exacta de agarose no importa siempre y cuando se controle para estar dentro ~ 0.9 - 1.1% y que los dos sustratos son de la misma concentración de agarose.
5. Tome el sustrato (parte inferior) de la cámara y la pipeta 1.000 μl de sustrato de agarose en cada vaguada como se ve en la Figura 1D.
6. Deje que la agarose se solidifique durante ~30 min.
7. Una vez que los sustratos de agarose y las moscas estén listas, ensambla los tres trozos de la cámara de puesta de huevos y luego saca las láminas de plástico.
8. Coloque las cámaras en incubadoras de moscas.
   NOTA: La duración de los experimentos de puesta de huevos puede variar dependiendo de las necesidades experimentales. Normalmente ejecutamos el experimento O/N (14 - 16 hr). Además, no se observó ningún impacto significativo del tiempo circadiano en las preferencias de puesta de huevos.
9. Anestesiar a las hembras inyectando CO₂ en la cámara. Desmontar la cámara, desechar las moscas anestesiadas en la morgue de moscas(es decir,una lata de café vacía llena de un poco de aceite de maíz). Tome fotografías de los resultados para la conservación de registros (consulte la Figura 2).
10. Cuente el número de huevos manualmente y calcule los índices de preferencia para su análisis. Calcular índice de preferencias como (N_a - N_b)/(N_a + N_b)donde N_a y N_b representan el número de huevos en el sitio a contra el sitio b, respectivamente.

Representative Results

Figura 1: Cámaras de puesta de huevos y protocolo de colocación de huevos. (A) Cámara de puesta de huevos completamente ensamblada. B) Piezas desmontadas. a: la pieza de carga (superior), b: la pieza divisor (centro), c: la pieza de sustrato (inferior). Los dibujos de ingeniería de estas piezas se muestran en la Figura Complementaria 1-3. (C) La pieza de carga de la cámara. a': puertas correderas, a": rieles. Las láminas de plástico se insertan en la pieza de carga para servir como un piso para mantener las moscas cargadas en su lugar. Normalmente ponemos cintas a color en el borde de las láminas de plástico (flecha roja). (D) El sustrato (inferior) y las piezas divisoras (centro) de la cámara. La agarose se deposita en valles individuales para servir como sustratos de puesta de huevos (flechas). Quadrilateral delinea la arena de puesta de huevos para una sola mosca. (E) Día 0 de hembras/machos recogidos en un vial con levadura. (F) Día 4 - 5 de hembras/machos recogidos en un vial de levadura. Tenga en cuenta que las larvas y las hembras adultas han comido la mayor parte de la levadura y la superficie de los alimentos se ha vuelto ocupada por larvas. Los alimentos húmedos de la superficie que se arrastran con larvas evitan que las hembras ponen más huevos en el vial. (G) Esquema que representa el protocolo para configurar experimentos de comportamiento de puesta de huevos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resultados representativos de la colocación de huevos para moscas que eligen entre sacarosa y sustratos lisos. (A) Vista lateral de los resultados de puesta de huevos de moscas de tipo salvaje cuando se les dio una opción entre sacarosa (150 mM) y sustratos lisos. Caja blanca delinea una arena de puesta de huevos para una sola mosca. (B) Vista superior de los resultados de puesta de huevos. Caja blanca delinea una arena de puesta de huevos para una sola mosca. (C) Índice de preferencia (PI) de moscas de tipo salvaje cuando se le pide que elija entre un sustrato que contiene sacarosa y un sustrato normal. La PI para cada hembra se calcula de la siguiente manera: (número de huevos sobre sustrato de sacarosa - número de huevos en los sustratos lisos)/número total de huevos. La barra de errores indica SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Dibujos de ingeniería para el divisor y la pieza del sustrato de la cámara. (A-A") Diferentes vistas de la pieza del sustrato de la cámara. (B-B') Diferentes vistas de la pieza divisora central de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 2: Dibujos de ingeniería para la pieza de carga de la cámara. (A-A') Diferentes vistas de la capa superior de la pieza de carga de la cámara. (B-B') Diferentes vistas de la capa inferior de la pieza de carga de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 3: Dibujo de ingeniería para la puerta corredera y el riel en la cámara. (A) El riel fijado en la parte superior de la cámara. (B) La puerta corredera de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC