Overview
يصف هذا الفيديو طريقة تقليدية قائمة على لوحة لقياس عمر C. elegans. يقيس البروتوكول المثال عمر الديدان المعالجة بالرنين.
Protocol
البروتوكول التالي هو مقتطف من كورنويل وآخرون، وطريقة مجموعة النسخة المتماثلة: نهج عالية الإنتاجية لقياس كميا Caenorhabditis elegans عمر، J. Vis. Exp. (2018).
1. منع إنتاج ذرية بإضافة 5-فلورو-2'-deoxyuridine (FUdR)
- زراعة الحيوانات حتى المرحلة L4 في 20 درجة مئوية. تحقق لمعرفة ما إذا كانت الحيوانات المتزامنة قد تطورت إلى L4 حوالي 40 ساعة بعد البذر (الخطوة 2.1.7).
ملاحظة: سي ييغانس وقت النمو سوف تختلف في درجات حرارة مختلفة ومعدلات نمو الحيوانات المتحولة التي لم يتم وصف معدلات يجب اختبارها تجريبيا.- إضافة 160 ميكرولتر من 50x FUdR إلى كل لوحة 6 سم مع الحيوانات L4.
ملاحظة: من المهم إضافة FUdR في مرحلة L4. للراحة، وجعل 1000x مخزون من FUdR عن طريق حل 1 غرام FUdR في 10 مل فائقة البور H 2 O. تصفيةتعقيمالأسهم FUdR مع مرشح 0.2 ميكرومتر وحقنة 10 سم مكعب. Aliquot ~ 1 مل من المخزون في أنابيب معقمة 1.5 مل. تجميد وتخزين في -20 درجة مئوية.
- إضافة 160 ميكرولتر من 50x FUdR إلى كل لوحة 6 سم مع الحيوانات L4.
- فحص لوحات لوجود الذكور C. elegans. إزالة جميع الذكور.
ملاحظة: يقاس العمر عادة للهرمافروديت وليس الذكور. Hermaphrodites أن رفيقة تعيش أقصر من الحيوانات غير المحشاة، حتى في وجود FUdR. الذكور أصغر وأرق من hermaphrodites ويمكن التعرف عليها بسهولة من قبل ذيل مدمن مخدرات مميزة. - ضع الصندوق مرة أخرى في حقيبة القفل البريدي. العودة إلى حاضنة 20 درجة مئوية.
2. القدرة على البقاء التهديف
- تسجيل قابلية البقاء يوميا عن طريق لمس بلطف الحيوان على رأسه مع سلك البلاتين أو رمش. تسجيل الحيوانات التي تفشل في التحرك كما الميت وإزالتها من لوحة (الشكل 1A). سجل العدد الذي تمت ملاحظته ميتا لكل حالة لكل نقطة زمنية للمراقبة.
ملاحظة: للحد من خطر التحيز التهديف، يجب أن يظل المجرب أعمى عن الظروف التجريبية وبالمثل يجب أن لا تشير إلى النتائج من النقاط الزمنية السابقة أثناء التسجيل. - فرض رقابة على الحيوانات التي تمزق، ويموت من عيوب التنمية واضحة أخرى، أو الزحف على جانب الطبق: إزالة هذه الحيوانات وتسجيل العدد في كل نقطة زمنية لوحظ للنظر في التحليل الإحصائي. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم العثور على الذكور، إزالتها وتسجيل العدد الملاحظ.
- كرر من الخطوة 2.1 يوميا حتى لا تبقى الحيوانات على قيد الحياة.
ملاحظة: وينبغي أن الحديقة من القولونية E. يقلل بشكل كبير أو الفطريات يبدأ في النمو على لوحة، ونقل جميع الحيوانات المتبقية إلى لوحة طازجة مع RNAi المناسبة وFUdR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1: الطريقة التقليدية وطريقة مجموعة النسخ المتماثلة لتسجيل عمر C.elegans (A). الطريقة التقليدية لتسجيل عمر C. elegans. ويتبع عدة مجموعات صغيرة متزامنة من الحيوانات متساوية المنشأ لكل حالة مع مرور الوقت. ويتبع نفس السكان من الحيوانات طوال الدورة الدراسية. يتم تقييم الجدوى عن طريق الحركة ، والتي يمكن تحفيزها عن طريق حث لطيف. يتم تسجيل الحيوانات التي تفشل في التحرك كما القتلى ويتم إزالتها (الطموح هو مبين) حتى لا تبقى الحيوانات قابلة للحياة. (ب). طريقة مجموعة النسخ المتماثلة لتسجيل عمر C. elegans. يتم توزيع عدد كبير من الحيوانات متساوية المنشأ المتزامنة مع العمر عبر عدد من لوحات تكرار متطابقة. في كل نقطة زمنية، يتم تسجيل تكرار واحد: يتم إضافة محلول مؤقت خفيف (M9)، مما يحفز الحركة. كما يتم تقييم الحيوانات التي تفشل في التحرك تلقائيا بعد آبار الفيضانات عن طريق التحفيز باللمس. يتم تحديد مدة التسجيل للتجربة قبل البداية. يتم تسجيل كل مرة واحدة فقط ويتم اشتقاق طول العمر للسكان الأكبر من العديد من الملاحظات المستقلة. (C). نهج مجموعة النسخ المتماثلة هو أسلوب الإنتاجية العالية لقياس كميا عمر C. elegans. يمكن تتبع 100 أو أكثر من استنساخ RNAi المستقلة في وقت واحد. يظهر HT115 E. القولونية التعبير عن dsRNA لاستنساخ RNAi معين. عمليا، يتم تقسيم كل 24 عينة من لوحة 96 بئرا إلى لوحة واحدة من 24 بئرا. كل لوحة 24 بئر الناتجة لديها سلبية(أي ناقلات فارغة، أحمر جيدا) والسيطرة الإيجابية (الأخضر جيدا) وزعت عشوائيا ضمن مجموعة من استنساخ RNAi (الآبار الصفراء). بشكل عام، يحتوي البئر الأول (A1) في مجموعة على متجه فارغ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
