Analyse de la durée de vie : Mesure de la longévité de C. elegans

Overview

Cette vidéo décrit une méthode traditionnelle à base de plaques de mesure de la durée de vie de C. elegans. Le protocole d’exemple mesure la durée de vie des vers traités avec RNAi.

Protocol

Le protocole suivant est un extrait de Cornwell et coll., The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitativement Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp.  (2018).

1. Prévenir la production de descendance par l’ajout de 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)

1. Faire pousser les animaux jusqu’au stade L4 à 20 °C. Vérifiez si les animaux synchronisés se sont développés à L4 environ 40 h après l’ensemencement (étape 2.1.7).
   REMARQUE : Le temps de développement de C. elegans variera à des températures et des taux de croissance différents des animaux mutants pour lesquels les taux n’ont pas été caractérisés doivent être testés empiriquement.
   1. Ajouter 160 μL de 50x FUdR à chaque plaque de 6 cm avec des animaux L4.
      REMARQUE: Il est essentiel d’ajouter FUdR à l’étape L4. Pour plus de commodité, faire 1000x stocks de FUdR en dissolvant 1 g FUdR en 10 mL ultrapure H₂O. Filter-stériliser stock FUdR avec un filtre de 0,2 μm et une seringue de 10 cc. Aliquot ~1 mL de bouillon en tubes stériles de 1,5 mL. Congeler et conserver à -20 °C.
2. Inspecter les plaques pour la présence de C. elegans mâle. Retirer tous les mâles.
   REMARQUE: La durée de vie est généralement mesurée pour les hermaphrodites et non pour les mâles. Les hermaphrodites qui s’accouplent vivent plus longtemps que les animaux non accouplés, même en présence de FUdR. Les mâles sont plus petits et plus minces que les hermaphrodites et peuvent être facilement identifiés par une queue accrochée distinctive.
3. Remettre la boîte dans le sac zip-lock. Retour à l’incubateur 20 °C.

2. Améliorer la viabilité

1. Marquez la viabilité quotidiennement en touchant doucement l’animal sur la tête avec un fil de platine ou un cil. Marquer les animaux qui ne se déplacent pas comme morts et les retirer de la plaque (Figure 1A). Enregistrez le nombre de morts observés pour chaque condition pour chaque point de temps d’observation.
   REMARQUE: Pour réduire le risque de biais de notation, l’expérimentateur doit rester aveugle aux conditions expérimentales et ne doit pas non plus référencer les résultats des points de temps précédents pendant la notation.
2. Censurer les animaux qui se rompent, meurent d’autres défauts de développement évidents, ou rampent sur le côté du plat: enlever ces animaux et enregistrer le nombre à chaque point de temps observé pour examen dans l’analyse statistique. De plus, si des mâles sont trouvés, retirez-les et enregistrez le nombre observé.
3. Répétez l’étape 2.1 tous les jours jusqu’à ce qu’aucun animal ne reste en vie.
   REMARQUE: Si la pelouse d’E. coli diminue considérablement ou si le champignon commence à pousser sur l’assiette, transférez tous les animaux restants dans une assiette fraîche avec l’ARNi et le FUdR appropriés.

Representative Results

Figure 1 : Méthode d’ensemble traditionnel et réplique pour marquer la durée de vie de C.elegans (A). La méthode traditionnelle pour marquer la durée de vie de C. elegans. Plusieurs petites populations synchronisées d’animaux isogéniques par condition sont suivies au fil du temps. La même population d’animaux est suivie tout au long du cours d’étude. La viabilité est évaluée par le mouvement, qui peut être stimulé par une légère pression. Les animaux qui ne se déplacent pas sont marqués comme morts et sont enlevés (aspiration démontrée) jusqu’à ce qu’aucun animal viable ne reste. (B). La méthode replica set pour marquer la durée de vie de C. elegans. Une grande population d’animaux isogéniques synchronisés par âge sont répartis sur un certain nombre de plaques de reproduction identiques. À chaque fois, une seule réplique est notée : une solution tamponnée douce (M9) est ajoutée, ce qui stimule le mouvement. Les animaux qui ne se déplacent pas spontanément après avoir inondé des puits sont également évalués au moyen d’un stimulus tactile. La durée de notation de l’expérience est déterminée avant le début. Chaque animal n’est marqué qu’une seule fois et la longévité de la population plus importante provient de nombreuses observations indépendantes. (C). L’approche Replica Set est une méthode à haut débit pour mesurer quantitativement la durée de vie de C. elegans. 100 clones RNAi indépendants ou plus peuvent être suivis simultanément. HT115 E. coli exprimant dsRNA pour un clone RNAi donné est montré. Pratiquement, tous les 24 échantillons de la plaque de 96 puits sont divisés en une seule plaque de 24 puits. Chaque plaque résultante de 24 puits a un contrôle négatif(vecteur vide, puits rouge) et positif (puits vert) réparti au hasard dans une collection de clones RNAi (puits jaunes). En règle générale, le premier puits (A1) d’une collection contient un vecteur vide. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/