Overview
このビデオでは 、C.エレガンスの寿命を測定する伝統的なプレートベースの方法について説明します。このプロトコルの例は、RNAi で処理されたワームの寿命を測定します。
Protocol
以下のプロトコルは、コーンウェルらからの抜粋です,レプリカセット法: 定量的に測定するハイスループットアプローチ カエノハブディティスエレガンスライフスパン, J. Vis. Exp. (2018).
1. 5-フルオロ-2'デオキシウリジン(FUdR)の添加による子孫の予防
- 20°CでL4段階になるまで動物を成長させる。 同期された動物が播種後約40時間L4に発達したかどうかを確認します(ステップ2.1.7)。
注:C.エレガンスの発達時間は、速度が特徴付けられていない突然変異動物の異なる温度と成長率で変化し、経験的にテストされなければならない。- L4動物と各6 cmのプレートに50x FUdRの160 μLを加えます。
注: L4 段階で FUdR を追加することが重要です。便宜上、1gのFUdRを10 mL超純粋H2O.フィルター滅菌ストックFUdRに0.2 μmフィルターと10ccシリンジで溶解して、FUdRの1,000x株を作ります。アリコート~1 mLの在庫は無菌1.5mLチューブに入った。凍結し、-20°Cで保存します。
- L4動物と各6 cmのプレートに50x FUdRの160 μLを加えます。
- 男性のC.エレガンスの存在のためにプレートを検査します。すべての男性を削除します。
注:寿命は通常、雌雄同体の測定であり、男性では測定されない。交尾する雌雄同体は、FUdRの存在下でも、未形成の動物よりも短く生きる。雄は雌雄同体よりも小さく薄く、特徴的な引っ掛け尾部によって容易に識別することができる。 - ボックスをジップロックバッグに戻します。20°Cインキュベーターに戻します。
2. 得点の実行可能性
- 白金ワイヤーまたはまつげで頭の上の動物を優しく触れることで、毎日生存率をスコア付けします。死んだ動物として動かなくなる動物をスコア付けし、プレートから取り除く(図1A)。各観測時間の各条件について、死んだ観測数を記録します。
注: スコアリングバイアスのリスクを減らすために、実験者は実験条件に目がくらみ続け、同様にスコアリング中に以前の時点からの結果を参照してはならない。 - 破裂する動物を検閲したり、他の明らかな発達上の欠陥で死んだり、皿の側面に這い上がったりする:これらの動物を取り除き、統計分析で考慮するために各観測された時点で数を記録する。さらに、男性が見つかった場合は、それらを削除し、観察された数を記録します。
- 動物が生きていないまで、毎日ステップ2.1から繰り返します。
注:大腸菌の芝生が著しく減少するか、または真菌がプレート上に成長し始めた場合は、残りのすべての動物を適切なRNAiおよびFUdRで新鮮なプレートに移す。
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Representative Results
図1:C.elegansの寿命(A)をスコアリングするための伝統的なレプリカセット法C.エレガンスの寿命を採点するための伝統的な方法。条件ごとにイソジェニック動物のいくつかの小さな同期集団が時間の経過とともに続く。同じ動物の集団が研究コースを通して続く。生存率は動きによって評価され、穏やかなプロディングによって刺激され得る。動きに失敗した動物は死んだものとして採点され、生存可能な動物が残らなくなるまで取り除かれる(熱望が示される)。(B) C.エレガンスの寿命を採点するためのレプリカセット法。年齢同期アイソジェニック動物の大規模な集団は、同一の複製プレートの数に分布しています。各時点で、単一の反復が採点されます:穏やかな緩衝溶液(M9)が加えられると、動きを刺激します。井戸を浸水した後に自発的に動かすことができない動物も、タッチ刺激を介して評価されます。実験のスコアリング期間は、開始前に決定されます。各動物は一度だけ採点され、より大きな集団の長寿は多くの独立した観察から導き出される。(C)レプリカ セットアプローチは、C. エレガンスの寿命を定量的に測定する高スループット方式です。100以上の独立したRNAiクローンを同時に追跡することができる。HT115大腸菌は、所定のRNAiクローンに対してdsRNAを発現することが示されている。実際には、96ウェルプレートから24サンプルごとに単一の24ウェルプレートに分割されています。得られた各24ウェルプレートは、RNAiクローン(黄色のウェル)のコレクション内にランダムに分布する負(すなわち空のベクトル、赤いウェル)と正のコントロール(緑色ウェル)を有する。通常、コレクション内の最初のウェル (A1) には空のベクトルが含まれます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
