Análisis de vida útil: Medición de la longevidad de C. elegans

Overview

Este video describe un método tradicional basado en placas para medir la vida útil de C. elegans. El protocolo de ejemplo mide la vida útil de los gusanos tratados con RNAi.

Protocol

El siguiente protocolo es un extracto de Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp.  (2018).

1. Prevención de la producción de progenie mediante la adición de 5-Fluoro-2'-deoxyuridina (FUdR)

1. Cultivar animales hasta la etapa L4 a 20 °C. Compruebe si los animales sincronizados se han desarrollado a L4 aproximadamente 40 h después de la siembra (paso 2.1.7).
   NOTA: El tiempo de desarrollo de C. elegans variará a diferentes temperaturas y las tasas de crecimiento de los animales mutantes para los que no se han caracterizado deben ser probadas empíricamente.
   1. Añadir 160 μL de 50x FUdR a cada placa de 6 cm con animales L4.
      NOTA: Es fundamental añadir FUdR en la etapa L4. Para mayor comodidad, haga 1.000x de existencias de FUdR disolviendo 1 g FUdR en 10 mL ultrapure H₂O. Stock de esterilización de filtro FUdR con un filtro de 0,2 μm y una jeringa de 10 cc. Aliquot ~ 1 mL de caldo en tubos estériles de 1,5 ml. Congelar y almacenar a -20 °C.
2. Inspeccione las placas para la presencia de C. elegans machos. Retiren a todos los machos.
   NOTA: La vida útil se mide típicamente para hermafroditas y no para los machos. Los hermafroditas que se aparean viven más cortos que los animales sin igual, incluso en presencia de FUdR. Los machos son más pequeños y delgados que los hermafroditas y pueden ser fácilmente identificados por una cola enganchada distintiva.
3. Vuelva a poner la caja en la bolsa de cierre de cremallera. Volver a la incubadora de 20 °C.

2. Viabilidad de la puntuación

1. Puntúe la viabilidad diariamente tocando suavemente al animal en la cabeza con un alambre de platino o una pestaña. Puntúe animales que no se muevan como muertos y retírelos de la placa (Figura 1A). Registre el número observado muerto para cada condición para cada punto de tiempo de observación.
   NOTA: Para reducir el riesgo de sesgo de puntuación, el experimentador debe permanecer ciego a las condiciones experimentales y del mismo modo no debe hacer referencia a los resultados de los puntos de tiempo anteriores durante la puntuación.
2. Censurar animales que se rompen, mueren por otros defectos evidentes del desarrollo, o se arrastran hacia arriba en el lado del plato: retiren estos animales y registren el número en cada punto de tiempo observado para su consideración en el análisis estadístico. Además, si se encuentran machos, retírelos y registre el número observado.
3. Repita desde el paso 2.1 todos los días hasta que ningún animal permanezca vivo.
   NOTA: Si el césped de E. coli disminuye significativamente o el hongo comienza a crecer sobre el plato, transfiera todos los animales restantes a un plato fresco con el RNAi y el FUdR apropiados.

Representative Results

Figura 1: El método tradicional y el conjunto de réplicas para puntuar la vida útil de C.elegans (A). El método tradicional para anotar C. elegans vida útil. Varias pequeñas poblaciones sincronizadas de animales isogénicos por condición son seguidas con el tiempo. La misma población de animales se sigue a lo largo del curso de estudio. La viabilidad se evalúa por movimiento, que puede ser estimulado por una protuberidad suave. Los animales que no se mueven son anotados como muertos y son eliminados (aspiración mostrada) hasta que no quedan animales viables. (B). El método de conjunto de réplicas para puntuar la vida útil de C. elegans. Una gran población de animales isogénicos sincronizados por edades se distribuyen a través de una serie de placas de réplica idénticas. En cada momento, se anota una sola réplica: se añade una solución amortiguada leve (M9), que estimula el movimiento. Los animales que no se mueven espontáneamente después de inundar pozos también son evaluados a través de estímulos táctiles. La duración de puntuación del experimento se determina antes del inicio. Cada animal se anota sólo una vez y la longevidad para la población más grande se deriva de muchas observaciones independientes. (C). El enfoque conjunto de réplicas es un método de alto rendimiento para medir cuantitativamente la vida útil de C. elegans. 100 o más clones independientes de RNAi se pueden rastrear simultáneamente. Se muestra HT115 E. coli que expresa dsRNA para un clon de ARN determinado. Prácticamente, cada 24 muestras de la placa de 96 pozos se dividen en una sola placa de 24 pozos. Cada placa de 24 pozos resultante tiene un negativo(es decir, vector vacío, pozo rojo) y control positivo (pozo verde) distribuido aleatoriamente dentro de una colección de clones RNAi (pozos amarillos). Normalmente, el primer pozo (A1) de una colección contiene un vector vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/