Livslängdsanalys: Mäta C. elegans livslängd

Overview

Denna video beskriver en traditionell, tallriksbaserad metod för att mäta livslängden på C. elegans. Exempelprotokollet mäter livslängden för maskar som behandlats med RNAi.

Protocol

Följande protokoll är ett utdrag från Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp.  (2018).

1. Förhindra avkommaproduktion genom tillsats av 5-Fluoro-2'-deoxyuridin (FUdR)

1. Odla djur fram till L4-scenen vid 20 °C. Kontrollera om synkroniserade djur har utvecklats till L4 cirka 40 timmar efter sådd (steg 2.1.7).
   OBS: C. elegans utvecklingstid kommer att variera vid olika temperaturer och tillväxthastigheter av mutanta djur för vilka priser inte har karakteriserats måste empiriskt testas.
   1. Tillsätt 160 μL 50x FUdR till varje 6 cm platta med L4-djur.
      OBS: Det är viktigt att lägga till FUdR i L4-skedet. För bekvämlighet, gör 1000x lager av FUdR genom att lösa upp 1 g FUdR i 10 mL ultrapure H₂O. Filtersterilisera lager FUdR med ett 0,2 μm filter och en 10 cc spruta. Aliquot ~1 ml lager i sterila 1,5 ml rör. Frys och förvara vid -20 °C.
2. Inspektera tallrikar för närvaron av manlig C. elegans. Ta bort alla män.
   OBS: Livslängden mäts vanligtvis för hermafroditer och inte män. Hermafroditer som parar sig lever kortare än omatade djur, även i närvaro av FUdR. Hanar är mindre och tunnare än hermafroditer och kan lätt identifieras av en distinkt krokad svans.
3. Lägg tillbaka lådan i zip-lock väskan. Återgå till 20 °C inkubator.

2. Poäng livskraft

1. Poäng livskraft dagligen genom att försiktigt röra djuret på huvudet med en platinatråd eller ögonfrans. Poängdjur som inte rör sig som döda och ta bort dem från plattan (Figur 1A). Registrera antalet observerade döda för varje tillstånd för varje observationstidpunkt.
   OBS: För att minska risken för poängsättning måste experimenteraren förbli blind för experimentella tillstånd och får på samma sätt inte referera till resultaten från tidigare tidpunkter under poängsättningen.
2. Censurera djur som brister, dör av andra uppenbara utvecklingsfel eller kryper upp på sidan av skålen: ta bort dessa djur och registrera antalet vid varje observerad tidpunkt för övervägande i den statistiska analysen. Dessutom, om män hittas, ta bort dem och registrera antalet observerade.
3. Upprepa från steg 2.1 dagligen tills inga djur lever.
   OBS: Om gräsmattan av E. coli minskar avsevärt eller svamp börjar växa på plattan, överför alla återstående djur till en färsk tallrik med lämplig RNAi och FUdR.

Representative Results

Bild 1: Den traditionella metoden och replikuppsättningsmetoden för att få C.eleganss livslängd (A). Den traditionella metoden för att göra C. elegans livslängd. Flera små synkroniserade populationer av isogena djur per tillstånd följs över tiden. Samma djurpopulation följs under hela studiekursen. Livskraften bedöms genom rörelse, som kan stimuleras av skonsam prodding. Djur som inte rör sig poängsätts som döda och avlägsnas (aspiration visas) tills inga livskraftiga djur återstår. (B). Replikuppsättningsmetoden för att få C. elegans livslängd. En stor population av ålderssynkronerade isogena djur fördelas över ett antal identiska replikatplattor. Vid varje tidpunkt poängsätts en enda replikat: en mild buffrad lösning (M9) tillsätts, vilket stimulerar rörelse. Djur som inte rör sig spontant efter översvämning av brunnar bedöms också genom beröringstimulans. Försökstiden för experimentet bestäms före starten. Varje djur poängsätts endast en gång och livslängden för den större populationen härrör från många oberoende observationer. (C). Replikuppsättningsmetoden är en metod med hög data flöde för att kvantitativt mäta C. elegans livslängd. 100 eller fler oberoende RNAi-kloner kan spåras samtidigt. HT115 E. coli uttrycker dsRNA för en given RNAi klon visas. Praktiskt taget är varje 24 prover från 96-brunnsplattan uppdelade i en enda 24-brunnsplatta. Varje resulterande 24-brunnsplatta har en negativ(dvs. tom vektor, röd brunn) och positiv kontroll (grön brunn) slumpmässigt fördelad inom en samling RNAi-kloner (gula brunnar). Vanligtvis innehåller den första brunnen (A1) i en samling en tom vektor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/