Yaşam Süresi Analizi: C. elegans'ın Uzun Ömürlülüğünün Ölçülmesi

Overview

Bu video, C. elegans'ın ömrünü ölçmek için geleneksel, plaka tabanlı bir yöntemi açıklar. Örnek protokol, RNAi ile tedavi edilen solucanların ömrünü ölçüyor.

Protocol

Aşağıdaki protokol, Cornwell ve ark.'dan bir alıntıdır,Replika Kümesi Yöntemi: Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp'iNicel Olarak Ölçmek için Yüksek Verimli Bir Yaklaşım.  (2018). 

1. 5-Floro-2'-deoksiroridin (FUdR) ilavesi ile soy üretiminin önlenmesi

1. 20 ° C'de L4 aşamasına kadar hayvan yetiştirin. Senkronize hayvanların tohumlamadan yaklaşık 40 saat sonra L4'e gelip gelmediğini kontrol edin (adım 2.1.7).
   NOT: C. elegans gelişim süresi farklı sıcaklıklarda değişecektir ve oranları karakterize olmayan mutant hayvanların büyüme oranları ampirik olarak test edilmelidir.
   1. L4 hayvanları ile her 6 cm plakaya 160 μL 50x FUdR ekleyin.
      NOT: L4 aşamasında FUdR eklemek önemlidir. Kolaylık sağlamak için, 1 g FUdR'yi 10 mL ultra saf H 2 O'ya eriterek_1.000xFUdR stokları yapın. Aliquot ~ 1 mL stok steril 1.5 mL tüpler içine. Dondurun ve -20 °C'de saklayın.
2. Plakaları erkek C. eleganların varlığı için inceleyin. Tüm erkekleri çıkarın.
   NOT: Yaşam süresi tipik olarak erkekler için değil, hermafroditler için ölçülür. Çiftleşmeyen hermafroditler, FUdR varlığında bile, unmated hayvanlardan daha kısa yaşarlar. Erkekler hermafroditlerden daha küçük ve daha incedir ve ayırt edici bir kancalı kuyrukla kolayca tanımlanabilir.
3. Kutuyu fermuarlı çantaya geri koy. 20 °C inkübatöre dönün.

2. Puanlama canlılığı

1. Platin tel veya kirpik ile hayvanın kafasına hafifçe dokunarak günlük canlılık puanı alın. Ölü olarak hareket edelim ve plakadan çıkarın (Şekil 1A). Her gözlem zaman noktası için her koşul için ölü olarak gözlenen sayıyı kaydedin.
   NOT: Puanlama önyargısı riskini azaltmak için, deneyci deneysel koşullara karşı kör kalmalı ve benzer şekilde puanlama sırasında önceki zaman puanlarından elde edilen sonuçlara başvurmamalıdır.
2. Yırtılan, diğer belirgin gelişim kusurlarından ölen veya yemeğin kenarına sürünen hayvanları sansürle: bu hayvanları çıkarın ve istatistiksel analizde değerlendirilmek üzere gözlemlenen her zaman noktasında sayıyı kaydedin. Ek olarak, erkekler bulunursa, bunları çıkarın ve gözlemlenen sayıyı kaydedin.
3. Hiçbir hayvan hayatta kalmayana kadar her gün 2.1 adımından tekrarlayın.
   NOT: E. coli çim önemli ölçüde azalırsa veya mantar plaka üzerinde büyümeye başlarsa, kalan tüm hayvanları uygun RNAi ve FUdR ile taze bir tabağa aktarın.

Representative Results

Şekil 1: C.elegans ömrünü (A) puanlamak için Geleneksel ve Yineleme Kümesi Yöntemi. C. elegans ömrünü puanlamak için Geleneksel Yöntem. Durum başına birkaç küçük senkronize izojenik hayvan popülasyonu zaman içinde takip edilir. Çalışma kursu boyunca aynı hayvan popülasyonu takip edilir. Canlılık, hafif prodding ile uyarılabilir hareketle değerlendirilir. Hareket edemeyen hayvanlar ölü olarak puanlanır ve uygun hayvan kalmayana kadar çıkarılır (aspirasyon gösterilir). (B). C. elegans ömrünü puanlamak için Çoğaltma Kümesi Yöntemi. Yaş senkronize izojenik hayvanların büyük bir popülasyonu, bir dizi özdeş çoğaltma plakasına dağıtılır. Her zaman noktasında, tek bir çoğaltma puanlanır: hareketi uyaran hafif bir tamponlanmış çözelti (M9) eklenir. Kuyuları su bastıktan sonra kendiliğinden hareket edemeyen hayvanlar da dokunma uyaranı ile değerlendirilir. Denemenin puanlama süresi başlangıçtan önce belirlenir. Her hayvan sadece bir kez puanlanır ve daha büyük popülasyon için uzun ömür birçok bağımsız gözlemden elde edilir. (C). Yineleme Kümesi yaklaşımı, C. elegans ömrünü nicel olarak ölçmek için yüksek aktarım hızı yöntemidir. 100 veya daha fazla bağımsız RNAi klonu aynı anda izlenebilir. Belirli bir RNAi klonu için dsRNA'yı ifade eden HT115 E. coli gösterilir. Pratik olarak, 96 kuyu plakasından her 24 örnek tek bir 24 kuyu plakasına ayrılır. Ortaya çıkan her 24 kuyu plakası, RNAi klonları (sarı kuyular) koleksiyonu içinde rastgele dağıtılan negatif(yani boş vektör, kırmızı kuyu) ve pozitif kontrole (yeşil kuyu) sahiptir. Genellikle, bir koleksiyondaki ilk kuyu (A1) boş bir vektör içerir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/