C. Elegans Blastomere Dissektion: En metode til at fjerne æggeskallen og dissociere embryonale celler

Overview

Denne video introducerer en metode til at isolere C. elegans blastomerer fra tidlige embryoner.  De resulterende celler er velegnede til cellekultur eller ex vivo-eksperimenter.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Hsu et al.,   In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp. (2019).

1. Isolering af embryo blastomere
2. Brug handsker og kittel for at undgå snit og kontakt med blegemiddelopløsningen.
   1. Hold hver ende af et mikrokapillær (kapacitet; 10 μL) med højre og venstre hånd.
   2. Træk mikrokapillæren mod begge ender for at påføre spænding og bringe midten af kapillæren over en brænder for at lave to håndtr trukket kapillærer(Figur 1A).
   3. Trim spidsen af de håndtrucerende kapillærer med pincet under dissekeremikroskopet, og fastgør den trukket kapillær i et mundpipetteringsapparat. Forbered to typer pipetter. Spidsens åbningsstørrelser for pipetterne skal være ca. 2x og 1x den korte akselængde på C. elegans embryoner (30 μm) til embryooverførsel og fjernelse af æggeskaller, henholdsvis figur 1B-D).
   4. Pipette 45 μL æggesaltopløsning på en brønd på et multiwell dias(figur 2A;bund).
   5. Placer 5-10 voksne C. elegans på en brønd indeholdende æggesaltopløsning.
   6. For at opnå tidlige C. elegans embryoner, skåret voksne i stykker ved at placere to nåle til højre og venstre for C. elegans krop og skubbe nåle forbi hinanden(Figur 2A; øvre skemaer).
   7. Pipette 45 μL hypochloritopløsning på en brønd ved siden af den velholdte æggesaltopløsning (Figur 2B).
   8. Pipette 45 μL af Sheltons vækstmedium på de efterfølgende tre brønde ved siden af den brøndholdige hypochloritopløsning (Figur 2B).
   9. 1-cellet stadium og tidlige 2-cellede embryoner overføres til hypochloritopløsningen ved mundpipetting med håndtegnede kapillær til overførsel af embryoner (figur 2B).
   10. Vent til 40-55 s.
   11. Embryonerne vaskes ved at overføre embryonerne fra hypochloritopløsningen til Sheltons vækstmedium ved mundpipetter med håndtegnet kapillær til embryooverførsel (Figur 2B).
   12. Vask embryonerne igen ved at overføre embryonerne til en ny brønd af Sheltons vækstmedium gennem mundpipetter med den håndtegnede kapillær til embryooverførsel (Figur 2B).
   13. Overfør de vaskede embryoner til en ny brønd af Sheltons vækstmedium gennem mundpipetter med den håndtegnede kapillær til embryooverførsel. Brug den håndtegnede kapillær til fjernelse af æggeskaller, gentag forsigtigt pipetterne (Figur 2C; midterste skemaer). Hvis æggeskallen fjernes med succes, bliver embryonale celler mere sfæriske(figur 2C; højre).
   14. Adskiller de 2-cellede embryonale blastomerer ved forsigtigt og kontinuerligt at pipette med den håndtegnede kapillær til fjernelse af æggeskaller (Figur 2D).

Figur 1: Blastomere isolation. (A)Træk i hånden af glaskapillær. (B) Håndtrukne glaskapillær til overførsel af embryoner. (C)Håndtegnet glaskapillær til fjernelse af æggeskaller. (D) Skemaer, der viser den passende størrelse kapillæråbning til fjernelse af æggeskallen. Pile angiver embryoner. Skalalinjer viser 100 μm.

Figur 2: Blastomere isolation workflow. (A)Dissektion af voksne C. elegans i æggesalt buffer for at få embryoner. Fotografier viser 2-cellede og 4-cellede scene embryoner før æggeskal fjernelse. (B) Behandling og vask af hypochlorit. (C) Skemaer viser den passende timing for fjernelse af æggeskaller. Fotografi viser en 4-cellet fase embryo efter æggeskal fjernelse. (D) Blastomere adskillelse. Fotografiet viser et adskilt 2-cellet scenefoster. Pilenes størrelse i C og D angiver de relative kræfter, der kræves under pipettering. Skalastænger viser 50 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.