C. elegans Blastomere Dissection: Eine Methode, um die Eierschale zu entfernen und embryonale Zellen zu dissoziieren

Overview

Dieses Video stellt eine Methode vor, C. elegans blastomeres von frühen Embryonen zu isolieren.  Die resultierenden Zellen eignen sich für Zellkultur- oder Ex-vivo-Experimente.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Hsu et al,   In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp. (2019).

1. Isolierung von Embryoblastomer
2. Tragen Sie Handschuhe und Labormantel, um Schnitt und Kontakt mit der Bleichlösung zu vermeiden.
   1. Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare (Kapazität; 10 L) mit der rechten und linken Hand.
   2. Ziehen Sie die Mikrokapillare an beiden Enden, um Spannung aufzutragen und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren zu machen (Abbildung 1A).
   3. Schneiden Sie die Spitzen der handgezogenen Kapillaren mit Zangen unter dem Seziermikroskop und befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mundpipettiergerät. Bereiten Sie zwei Arten von Pipetten vor. Die Spitzenöffnungsgrößen für die Pipetten sollten etwa 2x und 1x der kurzen Achslänge von C. elegans Embryonen (30 'm) für den Embryotransfer und die Eischalenentfernung bzw. Abbildung 1B-Dbetragen.
   4. Pipette 45 l Eisalzlösung auf einen Brunnen eines Multiwell-Schlittens(Abbildung 2A; unten).
   5. 5-10 erwachsene C. elegans auf eine gut enthaltende Eisalzlösung geben.
   6. Um frühe C. elegans Embryonen zu erhalten, schneiden Erwachsene in Stücke, indem Sie zwei Nadeln rechts und links des C. elegans Körpers positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben(Abbildung 2A; obere Schaltpläne).
   7. Pipette 45 l Hypochloritlösung auf einen Brunnen neben der gut haltigen Eisalzlösung(Abbildung 2B).
   8. Pipette 45 l des Wachstumsmediums von Sheltons auf die folgenden drei Brunnen neben der brunnenhaltigen Hypochloritlösung (Abbildung 2B).
   9. Übertragen Sie 1-Zell-Stadium- und frühe 2-Zellen-Embryon in die Hypochloritlösung durch Mundpipettieren mit der handgezeichneten Kapillare für embryonale Übertragung (Abbildung 2B).
   10. Warten Sie auf 40-55 s.
   11. Waschen Sie die Embryonen, indem Sie die Embryonen aus der Hypochloritlösung in Sheltons Wachstumsmedium übertragen, indem Sie mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer Pipettieren (Abbildung 2B).
   12. Waschen Sie die Embryonen erneut, indem Sie die Embryonen in einen neuen Brunnen von Sheltons Wachstumsmedium übertragen, indem Sie mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer Pipettieren (Abbildung 2B).
   13. Übertragen Sie die gewaschenen Embryonen in einen neuen Brunnen von Sheltons Wachstumsmedium durch Mundpipettieren mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer. Mit der handgezeichneten Kapillare für die Eischalenentfernung, sorgfältig wiederholen Sie die Pipettierung(Abbildung 2C; mittlere Schaltplan). Wenn die Eierschale erfolgreich entfernt wird, werden die embryonalen Zellen kugelförmiger(Abbildung 2C;rechts).
   14. Trennen Sie die 2-Zellen-Stadium embryonale Blastomere durch sanfte und kontinuierliche Pipettierung mit der handgezeichneten Kapillare für die Eischalenentfernung (Abbildung 2D).

Abbildung 1: Blastomere Isolation. (A) Handziehen der Glaskapillare. (B) Handgezeichnete Glaskapillare für embryonale Übertragung. (C) Handgezeichnete Glaskapillare zur Eischalenentfernung. (D) Schaltpläne, die die entsprechende Größe der Kapillaröffnung für die Eischalenentfernung anzeigen. Pfeile zeigen Embryonen an. Maßstabsbalken zeigen 100 m an.

Abbildung 2: Blastomere-Isolations-Workflow. (A) Zerlegung von erwachsenen C. eleganen in Eisalzpuffer, um Embryonen zu erhalten. Fotos zeigen 2-Zellen- und 4-Zellen-Bühnenembryonen vor der Eischalenentfernung. (B) Hypochloritbehandlung und -wäsche. (C) Schemata zeigen den geeigneten Zeitpunkt für die Entnahme von Eierschalen. Foto zeigt einen 4-Zellen-Stadium-Embryo nach der Eischalenentfernung. (D) Blastomere-Trennung. Das Foto zeigt einen getrennten 2-Zellen-Stadium-Embryo. Die Größen der Pfeile in C und D geben die relativen Kräfte an, die beim Pipetieren erforderlich sind. Maßstabsbalken zeigen 50 'm an.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.