C. elegans Blastomere Disseksjon: En metode for å fjerne eggeskall og dissosiere embryonale celler

Overview

Denne videoen introduserer en metode for å isolere C. elegans blastomerer fra tidlige embryoer.  De resulterende cellene er egnet for cellekultur eller ex vivo-eksperimenter.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Hsu et al,   In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads, J. Vis. Exp. (2019).

1. Isolering av embryo blastomer
2. Bruk hansker og labjakke for å unngå kutt og kontakt med blekemiddelløsningen.
   1. Hold i hver ende av en mikrokapillær (kapasitet; 10 μL) med høyre og venstre hånd.
   2. Trekk mikrokapselen mot begge ender for å påføre spenning og bringe midten av kapillæren over en brenner for å lage to håndtrekkede kapillærer (Figur 1A).
   3. Trim spissene på de håndtrekkede kapillærene med tang under dissekeringsmikroskopet og fest den trukket kapillæren i et munnpipetteringsapparat. Forbered to typer pipetter. Spissåpningsstørrelsene for pipettene skal være ca. 2x og 1x den korte akselengden på C. elegans embryoer (30 μm) for embryooverføring og eggeskallfjerning, henholdsvis figur 1B-D).
   4. Pipette 45 μL eggsaltoppløsning på en brønn med et flervelskred (Figur 2A; bunn).
   5. Plasser 5-10 voksne C. elegans på en godt inneholdende eggesaltløsning.
   6. For å oppnå tidlige C. elegans embryoer, kutt voksne i stykker ved å plassere to nåler til høyre og venstre for C. elegans kropp og skyve nålene forbi hverandre (Figur 2A; øvre skjemaer).
   7. Pipette 45 μL hypoklorittoppløsning på en brønn ved siden av brønnen som inneholder eggsaltoppløsning (Figur 2B).
   8. Pipette 45 μL av Sheltons vekstmedium på de påfølgende tre brønnene ved siden av brønnholdig hypoklorittløsning (figur 2B).
   9. Overfør 1-cellers stadium og tidlige 2-cellers stadium embryoer inn i hypoklorittoppløsningen ved munnpipettering med håndtegnet kapillær for embryooverføring (Figur 2B).
   10. Vent i 40–55 s.
   11. Vask embryoene ved å overføre embryoene fra hypoklorittoppløsningen til Sheltons vekstmedium ved munnpipettering med den håndtegnede kapillæren for embryooverføring (figur 2B).
   12. Vask embryoene igjen ved å overføre embryoene til en ny brønn av Sheltons vekstmedium ved munnpipettering med den håndtegnede kapillæren for embryooverføring (Figur 2B).
   13. Overfør de vaskede embryoene til en ny brønn av Sheltons vekstmedium ved munnpipettering med den håndtegnede kapillæren for embryooverføring. Bruk den håndtegnede kapillæren til fjerning av eggeskall, og gjenta pipetteringen forsiktig (Figur 2C; midtre skjemaer). Hvis eggeskallet fjernes vellykket, blir de embryonale cellene mer sfæriske (Figur 2C; høyre).
   14. Skill de 2-cellers embryonale blastomenes ved forsiktig og kontinuerlig pipettering med den håndtegnede kapillæren for fjerning av eggeskall (figur 2D).

Figur 1: Blastomere-isolasjon. (A) Håndtrekking av glass kapillær. (B) Håndtegnet glasskapillær for embryooverføring. (C) Håndtegnet glasskapillær for fjerning av eggeskall. (D) Skjemaer som viser riktig størrelse på kapillæråpningen for fjerning av eggeskall. Piler indikerer embryoer. Skalastenger viser 100 μm.

Figur 2: Blastomere-isolasjonsarbeidsflyt. (A) Disseksjon av voksne C. elegans i egg salt buffer for å oppnå embryoer. Fotografier viser 2-cellers og 4-cellers stadium embryoer før eggeskallfjerning. (B) Hypokloritt behandling og vasking. (C) Skjemaer viser riktig tidspunkt for fjerning av eggeskall. Fotografiet viser et 4-cellers stadium embryo etter fjerning av eggeskall. (D) Blastomere separasjon. Fotografiet viser et separert 2-cellers stadium embryo. Størrelsen på pilene i C og D angir de relative kreftene som kreves under pipettering. Skalastenger viser 50 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.