Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

К. Элеганс Бластерное вскрытие: метод удаления яичной скорлупы и диссоциации эмбриональных клеток

Overview

Это видео вводит метод изоляции C. elegans бластомеры от ранних эмбрионов.  Полученные клетки подходят для клеточной культуры или экспериментов ex vivo.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Hsu и др.,   In Vitro Восстановление пространственных клеточных контактных моделей с изолированными Caenorhabditis elegans эмбриона Blastomeres и клей полистирола бисера, J. Vis. Exp. (2019).

  1. Изоляция бластера эмбриона
  2. Носите перчатки и лабораторное пальто, чтобы избежать разреза и контакта с решением для отбеливания.
    1. Держите каждый конец микрокапильярии (емкость; 10 МКЛ) правой и левой рукой.
    2. Потяните микрокапильярии к обоим концам, чтобы применить напряжение и принести центр капилляра над горелкой, чтобы сделать два ручных капилляров (Рисунок 1A).
    3. Обрезать кончики ручной вытащил капилляры с миппами под рассечением микроскопа и прикрепить вытащил капилляр в рот пипетки аппарата. Приготовьте два типа пипеток. Размеры наконечника для пипеток должны быть примерно в 2 раза и 1 раз меньше длины оси эмбрионов C. elegans (30 мкм) для переноса эмбриона и удаления яичной скорлупы, соответственно Рисунок 1B-D).
    4. Pipette 45 йл раствора яичной соли на колодец многоярдовой горки(рисунок 2A; дно).
    5. Поместите 5-10 взрослых C. elegans на колодец, содержащий раствор яичной соли.
    6. Чтобы получить ранние эмбрионы C. elegans, разрежьте взрослых на куски, распоив две иглы справа и слева от тела C. elegans и сдвинув иглы мимо друг друга(рисунок 2A; верхняя схема).
    7. Pipette 45 йл раствора гипохлорита на колодец рядом с хорошо содержащим раствор яичной соли(рисунок 2B).
    8. Pipette 45 йл среды роста Шелтона на последующие три скважины рядом с скважиной, содержащей гипохлоритный раствор(рисунок 2B).
    9. Передача 1-клеточной стадии и ранних 2-клеточных эмбрионов стадии в гипохлоритный раствор путем трубы рта с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона(рисунок 2B).
    10. Подождите 40-55 с.
    11. Вымойте эмбрионы путем переноса эмбрионов из гипохлоритового раствора в среду роста Шелтона путем трубы рта с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона(рисунок 2B).
    12. Вымойте эмбрионы снова путем передачи эмбрионов в новый колодец роста среды Шелтона по рту трубопроводов с ручной капилляр для переноса эмбриона (Рисунок 2B).
    13. Перенесите вымытые эмбрионы в новую колодец среды роста Шелтона по трубе рта с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона. Используя нарисованную вручную капиллярную оболочку для удаления яичной скорлупы, тщательно повторитепипетку (рисунок 2C;средняя схема). Если яичная скорлупа будет успешно удалена, эмбриональные клетки станут более сферическими(рисунок 2C;справа).
    14. Разделите 2-клеточную стадию эмбриональных бластомер, мягко и непрерывно трубя с нарисованным вручную капилляром для удаления яичной скорлупы(рисунок 2D).

Figure 1
Рисунок 1: Изоляция Бластера. (A)Рука потянув стеклянной капиллярной. (B)Ручная нарисованная стеклянная капиллярная для переноса эмбриона. (C)Ручная нарисованная стеклянная капиллярная для удаления яичной скорлупы. (D)Схема, показывающая соответствующий размер капиллярного отверстия для удаления яичной скорлупы. Стрелки указывают на эмбрионы. Шкала баров показывает 100 мкм.

Figure 2
Рисунок 2: Рабочий процесс изоляции Blastomere. (A) Вскрытие взрослых C. elegans в буфере яичной соли для получения эмбрионов. Фотографии показывают 2-клеточные и 4-клеточные эмбрионы перед удалением яичной скорлупы. (B)Гипохлорит лечения и стирки. (C)Схема изображает подходящее время для удаления яичной скорлупы. Фотография показывает 4-клеточный эмбрион стадии после удаления яичной скорлупы. (D)Отделение Бладомера. Фотография показывает разделенный 2-клеточный эмбрион стадии. Размеры стрелок в C и D указывают на относительные силы, необходимые во время пипетки. Шкала баров показывает 50 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Пустое значение выпуск
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter