Overview
Это видео вводит метод изоляции C. elegans бластомеры от ранних эмбрионов. Полученные клетки подходят для клеточной культуры или экспериментов ex vivo.
Protocol
Этот протокол является выдержка из Hsu и др., In Vitro Восстановление пространственных клеточных контактных моделей с изолированными Caenorhabditis elegans эмбриона Blastomeres и клей полистирола бисера, J. Vis. Exp. (2019).
- Изоляция бластера эмбриона
- Носите перчатки и лабораторное пальто, чтобы избежать разреза и контакта с решением для отбеливания.
- Держите каждый конец микрокапильярии (емкость; 10 МКЛ) правой и левой рукой.
- Потяните микрокапильярии к обоим концам, чтобы применить напряжение и принести центр капилляра над горелкой, чтобы сделать два ручных капилляров (Рисунок 1A).
- Обрезать кончики ручной вытащил капилляры с миппами под рассечением микроскопа и прикрепить вытащил капилляр в рот пипетки аппарата. Приготовьте два типа пипеток. Размеры наконечника для пипеток должны быть примерно в 2 раза и 1 раз меньше длины оси эмбрионов C. elegans (30 мкм) для переноса эмбриона и удаления яичной скорлупы, соответственно Рисунок 1B-D).
- Pipette 45 йл раствора яичной соли на колодец многоярдовой горки(рисунок 2A; дно).
- Поместите 5-10 взрослых C. elegans на колодец, содержащий раствор яичной соли.
- Чтобы получить ранние эмбрионы C. elegans, разрежьте взрослых на куски, распоив две иглы справа и слева от тела C. elegans и сдвинув иглы мимо друг друга(рисунок 2A; верхняя схема).
- Pipette 45 йл раствора гипохлорита на колодец рядом с хорошо содержащим раствор яичной соли(рисунок 2B).
- Pipette 45 йл среды роста Шелтона на последующие три скважины рядом с скважиной, содержащей гипохлоритный раствор(рисунок 2B).
- Передача 1-клеточной стадии и ранних 2-клеточных эмбрионов стадии в гипохлоритный раствор путем трубы рта с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона(рисунок 2B).
- Подождите 40-55 с.
- Вымойте эмбрионы путем переноса эмбрионов из гипохлоритового раствора в среду роста Шелтона путем трубы рта с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона(рисунок 2B).
- Вымойте эмбрионы снова путем передачи эмбрионов в новый колодец роста среды Шелтона по рту трубопроводов с ручной капилляр для переноса эмбриона (Рисунок 2B).
- Перенесите вымытые эмбрионы в новую колодец среды роста Шелтона по трубе рта с нарисованным вручную капилляром для переноса эмбриона. Используя нарисованную вручную капиллярную оболочку для удаления яичной скорлупы, тщательно повторитепипетку (рисунок 2C;средняя схема). Если яичная скорлупа будет успешно удалена, эмбриональные клетки станут более сферическими(рисунок 2C;справа).
- Разделите 2-клеточную стадию эмбриональных бластомер, мягко и непрерывно трубя с нарисованным вручную капилляром для удаления яичной скорлупы(рисунок 2D).
Рисунок 1: Изоляция Бластера. (A)Рука потянув стеклянной капиллярной. (B)Ручная нарисованная стеклянная капиллярная для переноса эмбриона. (C)Ручная нарисованная стеклянная капиллярная для удаления яичной скорлупы. (D)Схема, показывающая соответствующий размер капиллярного отверстия для удаления яичной скорлупы. Стрелки указывают на эмбрионы. Шкала баров показывает 100 мкм.
Рисунок 2: Рабочий процесс изоляции Blastomere. (A) Вскрытие взрослых C. elegans в буфере яичной соли для получения эмбрионов. Фотографии показывают 2-клеточные и 4-клеточные эмбрионы перед удалением яичной скорлупы. (B)Гипохлорит лечения и стирки. (C)Схема изображает подходящее время для удаления яичной скорлупы. Фотография показывает 4-клеточный эмбрион стадии после удаления яичной скорлупы. (D)Отделение Бладомера. Фотография показывает разделенный 2-клеточный эмбрион стадии. Размеры стрелок в C и D указывают на относительные силы, необходимые во время пипетки. Шкала баров показывает 50 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |