C. elegans Blastomere Diseksiyonu: Yumurta Kabuğunun Çıkarılması ve Embriyonik Hücrelerin Ayrıştırılması için Bir Yöntem

Overview

Bu video, C. elegans blastomeres'i erken embriyolardan izole etme yöntemini tanıtmaktadır.  Elde eden hücreler hücre kültürü veya ex vivo deneyleri için uygundur.

Protocol

Bu protokol, Hsu ve ark,   İzole Caenorhabditis elegans Embriyo Blastomeres ve Yapışkan Polistiren Boncuklar , J. Vis. Exp. (2019) ile Mekansal Hücre Temas ModellerininIn Vitro Reconstitution'undan bir alıntıdır.

1. Embriyo blastomere izolasyonu
2. Ağartma solüsyonunun kesilmesini ve temas etmesini önlemek için eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin.
   1. Bir mikrokapilinin (kapasite; 10 μL) her ucunun her ucunun sağ ve sol eliyle tutun.
   2. Gerdirme uygulamak için mikrokapilleri her iki uca doğru çekin ve iki elle çekilmiş kılcal damar yapmak için kılcal damarın merkezini bir brülörün üzerine getirin (Şekil 1A).
   3. Elle çekilen kılcal damarların uçlarını diseksiyon mikroskobu altında tokalarla kırpın ve çekilen kılcal damarı bir ağız pipetleme aparatına takın. İki tip pipet hazırlayın. Pipetler için uç açma boyutları, embriyo transferi ve yumurta kabuğu çıkarılması için C. elegans embriyolarının (30 μm) kısa eksen uzunluğunun yaklaşık 2x ve 1 katı olmalıdır, sırasıyla Şekil 1B-D).
   4. Pipet 45 μL yumurta tuzu çözeltisi çok katlı bir slayt kuyusuna(Şekil 2A; alt).
   5. 5-10 yetişkin C. elegans'ı yumurta tuzu çözeltisi içeren bir kuyuya yerleştirin.
   6. Erken C. elegans embriyoları elde etmek için, C. elegans vücudunun sağına ve soluna iki iğne yerleştirip iğneleri birbirlerinin yanından kaydırarak yetişkinleri parçalara ayırın (Şekil 2A; üst şemalar).
   7. Pipet 45 μL hipoklorit çözeltisi, yumurta tuzu çözeltisi içeren kuyunun yanındaki bir kuyuya (Şekil 2B).
   8. Shelton'un büyüme ortamının pipet 45 μL'si, hipoklorit çözeltisi içeren kuyunun yanındaki sonraki üç kuyuya (Şekil 2B).
   9. 1 hücreli evre ve erken 2 hücreli evre embriyoları embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damar ile ağız pipetleme ile hipoklorit çözeltisine aktarın (Şekil 2B).
   10. 40-55 sn bekleyin.
   11. Embriyoları hipoklorit çözeltisinden Shelton'un büyüme ortamına embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damarla ağız pipetleme ile aktararak yıkayın (Şekil 2B).
   12. Embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damarla ağız pipetleme ile embriyoları Shelton'un büyüme ortamının yeni bir kuyusuna aktararak embriyoları tekrar yıkayın (Şekil 2B).
   13. Yıkanmış embriyoları, embriyo transferi için elle çizilmiş kılcal damarla ağız pipetleme ile Shelton'ın büyüme ortamının yeni bir kuyusuna aktarın. Yumurta kabuğunun çıkarılması için elle çizilmiş kılcal damarı kullanarak pipetlemi dikkatlice tekrarlayın (Şekil 2C; orta şemalar). Yumurta kabuğu başarıyla çıkarılırsa, embriyonik hücreler daha küresel hale gelecektir(Şekil 2C; doğru).
   14. 2 hücreli evre embriyonik blastomerleri yumurta kabuğu çıkarmak için elle çizilmiş kılcal damarla hafifçe ve sürekli pipetleme ile ayırın (Şekil 2D).

Şekil 1: Blastomere izolasyonu. (A) Cam kılcal damarların elle çekilmesi. (B) Embriyo transferi için elle çizilmiş cam kılcal damar. (C) Yumurta kabuğu çıkarmak için elle çizilmiş cam kılcal damar. (D) Yumurta kabuğunun çıkarılması için uygun kılcal damar açıklığını gösteren şemalar. Oklar embriyoları gösterir. Ölçek çubukları 100 μm gösterir.

Şekil 2: Blastomere yalıtım iş akışı. (A) Embriyo elde etmek için yumurta tuzu tamponunda yetişkin C. eleganların diseksiyonu. Fotoğraflarda yumurta kabuğu çıkarılmadan önce 2 hücreli ve 4 hücreli evre embriyolar göstermektedir. (B) Hipoklorit tedavisi ve yıkama. (C) Şemalar yumurta kabuğunun çıkarılması için uygun zamanlamayı tasvir etti. Fotoğraf, yumurta kabuğu çıkarıldıktan sonra 4 hücreli bir evre embriyo gösterir. (D) Blastomere ayrımı. Fotoğrafta 2 hücreli ayrı bir evre embriyo görülüyor. C ve D'deki okların boyutları pipetleme sırasında gereken göreli kuvvetleri gösterir. Ölçek çubukları 50 μm gösterir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.