ג. אלגנס Chemotaxis Assay: שיטה לבדיקת כימוסנסציה בתולעים

Overview

וידאו זה מציג chemotaxis ב nematode C. elegans ומראה פרוטוקול מדגם בדיקת סלידה chemotactic נחושת גופרתי.

Protocol

הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך קמפבל ואח ', elegans Caenorhabditis מצב תזונתי מבוסס נחושת Asay, J. Vis. Exp. (2017).

1. הכנת אורגניזמים ניסיוניים
   1. בחר 10 L4 מבוים nematodes לכל זן 24 שעות לפני תחילת ההסתעפות כדי להבטיח כי אורגניזמים הם צעירים כאשר נבדק. עבור כל מוטציה או נמטודה בקרה נבדק, לבחור 10 L4s (10 עבור הפקד ו 10 עבור assay).
      1. לשמור על אורגניזמים L4 בשיטות סטנדרטיות עבור 24 שעות על לוחות אגר סטנדרטיים זרעים עם OP50 Escherichia coli. אם אורגניזמים הולכים לאיבוד במהלך שלבי הכביסה הבאים, לפצות על ידי הגדלת גודל המדגם ההתחלתי (כלומר לבחור 20 תולעים במקום 10).
         שים לב: התנהגות היא פנוטיפ משתנה מולד. בצע את השיטה משולשת עבור כל זן בשלושה ימים נפרדים. כלול זנים שליטה נוספים ותנאים עבור זנים חדשים, כפי שהודגש בסעיף הדיון.
   2. מיד לפני בדיקה, להעביר אורגניזמים ניסיוניים לצלחת אגר ללא חיידקים ולאפשר nematodes לנוע בחופשיות במשך 1 דקות כדי להסיר חיידקים עודפים.
      1. אם אורגניזמים ניסיוניים חוו תנאי זיהום במהלך 24 שעות לפני ההסתעפות, להשליך אותם.
   3. פיפטה 1 מ"ל של M9 על צלחת ללא חיידקים לשטוף תולעים לתוך צינור microcentrifuge.
   4. צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 1 דקות. תולעים צריכות ליצור גלולה בתחתית הצינור. לשאוף פתרון M9 מבלי לשבש את גלולת התולעת. הוסף 1 מ"ל של M9 לכדור התולעת, צינור הפוך לערבב תולעים עם הפתרון.
   5. חזור על שלבים 1.4 שלוש פעמים נוספות.
      1. אם חיידקים עודפים הועברו בתחילה עם התולעים, חזרו על הפעולה בסך הכל 5 פעמים. אין להעביר חיידקים לצלחות מירוץ המזון מנחושת. אם המזון מועבר לצלחת ההסתעפות, זה יפריע לאיסוף נתונים מדויק.
   6. לאחר הכביסה הסופית, לשאוף supernatant עד 100 μL של M9 ואת גלולת התולעת נשאר.
      זהירות: התנהגויות הקשורות לרעב ניכרות לאחר 30 דקות. כתוצאה מכך תולעים צריך להיות מועבר באופן מיידי מן הפתרון לאחר שלבי לשטוף הושלמו.
2. הכנת צלחות אסאי
   1. הכינו לוחות אגר סטנדרטיים של NGM יומיים לפני הבחינה.
      1. אם הצלחות נשמרות בסביבה לחה, להכין צלחות אגר 3 ימים לפני ההסתעפות. לחלופין, להסיר את המכסה של הצלחת במשך 3 - 6 שעות כדי להבטיח יובש נאות (אם בסביבה סטרילית).
   2. בעזרת סמן קבוע עבה, קבעו קו בחלק התחתון של הצלחת לאורך הקצה החיצוני וקו אחר ליצירת מחסום אמצע קו (איור 1). מחסום אמצע הקו צריך להיות שווה ערך מכל קצה של הצלחת. השתמש בסרגל כדי להבטיח מדידות מדויקות. קווים אלה ישמשו כמדריך בעת העברת חיידקים ותמיסת הנחושת. בתנאי ש- E. coli מועבר לפני פתרון הנחושת, קווים אלה ישמשו כאינדיקטורים.
   3. צלחת זרעים עם 50 μL של OP50 E. coli רק בצד אחד של מחסום הנחושת כדי ליצור מדשאה אחידה (איור 2). ריכוז חיידקים צריך להישאר עקבי על פני מבחנים; עם זאת, שונות קטנה נצפתה בתגובה להבדלים קלים בריכוז.
      1. השתמש בקווים המסומנים בחלק התחתון של הצלחת כדי להבטיח שהחיידקים לא יבואו במגע עם פתרון הנחושת. בתנאי שתמיסת הנחושת תיישר את קצה הצלחת ויוצרת מחסום אמצע קו, העבר את החיידקים כך שתמיסת הנחושת לא תבוא במגע עם מקור המזון.
   4. סמן קבוצה שנייה של לוחות והעבר אליהם את OP50 E. coli (איור 2). לוחות אלה ישמשו להערכת השליטה השלילית. לוחות אלה צריכים להיות גם סימון על חצי אחד של הצלחת כדי לציין את מקור ההעברה הראשונית.
   5. אפשר חיידקים להתייבש ואז לדגר צלחות ב 37 מעלות צלזיוס לילה. ודאו שמדבקות חיידקים אינן מופרעות בעת העברה לחממה או לחדר ב-37 מעלות צלזיוס. הפרעה מוגזמת יכולה לשנות את המיקום או הצורה של תיקון המזון.
3. מבחני צ'מוטקסיס
   1. הטרי להכין פתרון נחושת 0.5 M (II) סולפט לפני זמן ההתחלה של assay. בתנאי כי 125 μL של הפתרון משמש לכל צלחת, להגדיל את נפח זה תלוי במספר לוחות assay בשימוש(למשל 5 לוחות assay, 625 μL).
   2. פיפטה 100 μL של נחושת (II) פתרון סולפט על קצה האגר כדי ליצור מחסום נחושת חיצוני. החלק התחתון המסומן של הצלחת צריך לשמש כמדריך.
   3. פיפטה 25 μL של נחושת (II) פתרון סולפט כדי ליצור מחסום קו האמצע.
      1. ודא כי נחושת (II) פתרון סולפט לא בא במגע עם תיקון חיידקי. השתמש בטכניקה מנוקדת כמו פסים עלולים להשפיע על תנועה עקב כניסות / שריטות על אגר.
   4. אפשר לתמיסת הנחושת להתייבש על הצלחת. פרק הזמן יכול להשתנות בהתאם לתנאי הצלחת והמעבדה. בדוק חזותית יובש כל 5 דקות לאחר ההעברה.
      שים לב: פתרון הנחושת מציג גוון כחול וניתן לזיהוי בקלות. השתמש ברקמת מעבדה כדי לטבול קלות את הפתרון ליד קצה הצלחת כדי להבחין ביובש.
   5. פיפטה 20 μL של גלולת התולעת מתחתית הצינור אל החצי ללא חיידקים של צלחת התסמין.
      1. ודא כי 10 תולעים מועברות ללוחית התסעפות. אם תולעים נוספות נכללו בטעות, להסיר אותם על ידי קטיף עם שמן halocarbon כדי להבטיח כי אין חיידקים מתווספים לצלחת. לכל מבחנה צריך להיות מספר עקבי של נמטודות במהלך ההסתעפות.
         שים לב: אם מעט מדי תולעים מועברות במהלך מבחנים, הגדלת גודל המדגם הראשוני תפחית את ההפסדים הפוטנציאליים במהלך שטיפות והעברות.
   6. הסר M9 עודף מהצלחת עם רקמת מעבדה. M9 לא צריך לבוא במגע עם נחושת (II) פתרון סולפט.
      זהירות: ודאו שהתולעים ומשטח האגר לא יושפעו בעת ביצוע שלב זה. אם נעשה שימוש קשה מדי, רקמת המעבדה יכולה ליצור חריצים על פני השטח אגר של הצלחת והוא יכול להסיר תולעים. תולעים שהוסרו בטעות באמצעות KimWipe יש להשליך.
   7. לאחר שפתרון M9 הוסר וכל התולעים החלו דפוסי locomotory שאינם נוזליים, להתחיל את שעון העצר.
      1. באופן אופטימלי, להסיר את הפתרון M9 בתוך דקה. הפרמטר המהותי הוא זיהוי תנועה סינוסואידית. תולעים תנועה אחרת, למשל חבטות ולא סינוסואידי, כאשר בנוזל. התחל את ההסתעפות להפסיק לצפות פעם כל אחד האורגניזמים הניסיוניים מפסיק חבטה.
   8. בדוק צלחות בדיקה כל 30 דקות.
      1. עבור צלחות מבחנים עם כתמים חיידקיים, באופן חיובי ציון אורגניזמים אם הם מגיעים תיקון מזון על פני תקופה של 4 שעות. עבור לוחות הבקרה השליליים, באופן חיובי ציון אורגניזמים אם הם חצו את המחסום.

Representative Results

איור 1: ייצוג חזותי של סימונים לציון מיקום פתרון נחושת בחלק התחתון של צלחת פטרי 5 ס"מ. אינדיקציות אלה משמשות כדי להבטיח כי החלקים של הצלחת נמדדו כראוי לשמש קו מנחה בעת העברת תיקון חיידקי ולאחר מכן פתרון נחושת על פני השטח אגר.

איור 2: צלחת פטרי 5 ס"מ מחולקת לשני חלקים עבור צלחות Assay מזון לסירוגין מדשאה חיידקית נוצרת במרכז אחד החלקים האלה עבור צלחת על מזון. תיקון המזון לא צריך לבוא במגע עם תרכובת הבדיקה אשר קווים את הקצוות של הצלחת ויוצר מחסום קו האמצע.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M