C. 예인대 화학 분석: 벌레에서 화학 감각을 테스트 하는 방법

Overview

이 비디오는 선충 C. elegans에 있는 화학 요법을 소개하고 구리 황산염에 화학 전술 혐오를 시험하는 견본 프로토콜을 보여줍니다.

Protocol

다음 프로토콜은 캠벨 외에서 발췌, A Caenorhabditis elegans 영양 상태 기반 구리 혐오 분석, J. Vis. Exp. (2017).

1. 실험 유기체의 준비
   1. 시험할 때 유기체가 젊은 성인이 되도록 분석서를 시작되기 전에 균주 당 10 L4 단계선 24 시간 선택하십시오. 테스트된 각 돌연변이 또는 제어 선충에 대해 10L4s(컨트롤용 10개, 분석용 10개)를 선택합니다.
      1. OP50 에슈리치아 대장균으로시드된 표준 한천 플레이트에서 24h표준 방법을 사용하여 L4 유기체를 유지한다. 후속 세척 단계에서 유기체가 분실되는 경우, 시료 크기를 증가시킴으로써보상한다(즉, 10개가 아닌 20개의 벌레를 선택하십시오).
         참고: 동작은 선천적으로 가변 표현형입니다. 3일 동안 각 변형에 대해 트리플리케이트로 메서드를 수행합니다. 토론 섹션에서 강조 표시된 대로 새로운 균주에 대한 추가 제어 균주와 조건을 포함합니다.
   2. 분석 직전에 실험 유기체를 박테리아가없는 천창 판에 옮기고 선충이 1 분 동안 자유롭게 이동하여 과도한 박테리아를 제거 할 수 있습니다.
      1. 실험 유기체가 분석 전에 24 시간 동안 오염 조건을 경험한 경우 폐기하십시오.
   3. 파이프 1 mL ML M9 박테리아 가 없는 접시에 벌레를 마이크로 센심 분리기 튜브로 씻어.
   4. 원심 분리기 3,000 x g에서 1 분 동안. 벌레는 튜브 의 바닥에 펠릿을 형성해야합니다. 웜 펠릿을 방해하지 않고 M9 용액을 흡인합니다. 벌레 펠릿에 M9 1mL을 추가하고, 벌레를 용액과 섞어 튜브를 반전시십시오.
   5. 단계를 1.4세 이상 반복합니다.
      1. 과잉 박테리아가 처음에 벌레로 옮겨진 경우에, 총 5 회 반복하십시오. 어떤 박테리아도 구리 식품 경주 판으로 옮겨서는 안됩니다. 음식이 분석 판으로 전송되면 정확한 데이터 수집을 방해합니다.
   6. 마지막 세척 후, M9의 100 μL까지 흡인 슈퍼 내역과 벌레 펠릿이 남아 있습니다.
      주의: 기아 관련 행동은 30분 후에 명백해집니다. 따라서 세척 단계가 완료되면 웜을 즉시 용액에서 옮겨야 합니다.
2. 분석 판의 준비
   1. 분석 하기 이틀 전에 표준 NGM 한천 판을 준비 합니다.
      1. 플레이트가 습한 환경에 보관되면 분석 3일 전에 한천판을 만듭니다. 또는 적절한 건조를 보장하기 위해 플레이트 뚜껑을 3-6시간 동안 제거하여 적절한 건조성을 보장합니다(멸균 환경에서는).
   2. 두꺼운 영구 마커로, 외부 가장자리를 따라 플레이트의 밑면에 선을 만들고 다른 한 쪽은 중간 선장벽(도 1)을형성한다. 중간 선 장벽은 플레이트의 각 가장자리와 동등해야 합니다. 눈금자를 사용하여 정확한 측정을 보장합니다. 이 라인은 박테리아와 구리 용액을 전송할 때 가이드역할을 할 것입니다. 대장균이 구리 용액 보다 이전에 전달되는 경우, 이러한 라인은 지표역할을 합니다.
   3. 구리 장벽의 한쪽에만 OP50 대장균의 50 μL이 있는 종자 플레이트는 균일한 잔디를 만듭니다(도 2). 세균성 농도는 에세이를 통해 일관되게 유지되어야 합니다. 그러나, 농도의 가벼운 차이에 대 한 응답으로 작은 가변성이 관찰 되었습니다.
      1. 박테리아가 구리 용액과 접촉하지 않도록 플레이트 밑면의 표시된 선을 사용합니다. 구리 용액이 플레이트의 가장자리를 라인으로 정렬하고 중간 선 장벽을 형성하는 경우, 구리 용액이 식품 공급원과 접촉하지 않도록 박테리아를 이송한다.
   4. 플레이트의 두 번째 세트를 표시하고 그들에게 OP50 대장균을 전송하지(그림 2). 이 플레이트는 음의 제어를 평가하는 역할을 합니다. 이 플레이트는 또한 초기 전송 기원을 나타내기 위해 플레이트의 절반에 표시가 있어야 합니다.
   5. 박테리아가 건조한 다음 하룻밤 사이에 37°C에서 플레이트를 배양할 수 있습니다. 37°C 인큐베이터 또는 룸으로 옮길 때 세균 성 패치가 방해되지 않도록 하십시오. 과도한 방해는 음식 패치의 위치 또는 모양을 변경할 수 있습니다.
3. 화학 요법 분석
   1. 분석 시작 시간 전에 0.5M 구리(II) 황산염 용액을 신선하게 준비합니다. 용액의 125 μL이 플레이트당 사용되는 경우, 사용되는 분석플레이트(예: 5 분석 플레이트, 625 μL)의 수에 따라 이 부피를 확장합니다.
   2. 파이펫 100 μL의 구리(II) 황산염 용액이 화서 가장자리에 있는 외부 구리 장벽을 생성합니다. 플레이트의 밑면이 표시된 것은 가이드역할을 해야 합니다.
   3. 구리(II) 황산염 용액의 파이펫 25 μL이 중간선 장벽을 생성합니다.
      1. 구리(II) 황산염 용액이 세균 성 패치와 접촉하지 않도록 하십시오. 줄무늬가 한천의 들여쓰기/스크래치로 인해 운동에 영향을 줄 수 있는 것으로 점박이 기술을 사용합니다.
   4. 구리 용액이 접시에 건조하도록 허용합니다. 기간은 플레이트 및 실험실 조건에 따라 다를 수 있습니다. 전송 후 5분마다 건조함을 시각적으로 확인합니다.
      참고: 구리 용액은 파란색 색조를 표시하고 쉽게 식별 할 수 있습니다. 실험실 조직을 사용하여 접시 가장자리 근처의 용액을 가볍게 두드려 건조함을 분별하십시오.
   5. 파이프 20 μL의 벌레 펠릿은 튜브 의 바닥에서 분석 플레이트의 박테리아가없는 절반으로.
      1. 10개의 웜이 분석판으로 이송되는지 확인합니다. 여분의 벌레가 실수로 포함 된 경우, 접시에 박테리아가 추가되지 않도록 할로카본 오일로 따기하여 제거합니다. 각 분석서는 분석 중에 일관된 수의 선충을 가져야 합니다.
         참고: 애사 중에 웜이 너무 적으면 초기 샘플 크기를 늘리면 세차 및 전송 중에 잠재적인 손실이 완화됩니다.
   6. 실험실 조직으로 접시에서 초과 M9을 제거합니다. M9은 구리(II) 황산염 용액과 접촉해서는 안 됩니다.
      주의: 이 단계를 수행하는 동안 웜과 한천 표면이 영향을 받지 않도록 합니다. 너무 가혹하게 사용되는 경우, 실험실 조직은 플레이트의 천 표면에 들여 쓰기를 만들 수 있으며 벌레를 제거 할 수 있습니다. 김슬쩍을 통해 실수로 제거된 웜은 폐기해야 합니다.
   7. M9 용액이 제거되고 모든 웜이 비액체 운동 패턴을 시작하면 분석 스톱워치를 시작합니다.
      1. 최적으로 M9 솔루션을 1분 이내에 제거합니다. 필수 매개 변수는 부비동 엽운동의 식별입니다. 웜 은 액체에있을 때 부비동이성보다는 스래싱과 같은 다르게 locomote합니다. 각 실험 유기체가 스래싱을 멈추면 분석 정지 시계를 시작합니다.
   8. 30분마다 분석 접시를 확인하십시오.
      1. 세균성 패치를 가진 분석 판의 경우, 4 시간 기간 동안 음식 패치에 도달하면 유기체를 긍정적으로 점수. 음의 대조판의 경우, 장벽을 넘으면 유기체를 긍정적으로 점수로 매길 수 있습니다.

Representative Results

그림 1: 5cm 페트리 접시 의 밑면에 구리 솔루션 배치를 나타내는 표시의 시각적 표현. 이러한 표시는 세균 성 패치를 전송한 다음 구리 용액을 한천 표면으로 옮길 때 플레이트의 단면도를 적절하게 측정하고 지침역할을 하는 데 사용됩니다.

그림 2: 5cm 페트리 접시는 식품 분석 접시 안팎의 두 부분으로 나뉘며, 세균성 잔디는 온 푸드 플레이트섹션 중 하나에 형성된다. 식품 패치는 플레이트의 가장자리를 정렬하고 중간 선 장벽을 형성하는 테스트 화합물과 접촉해서는 안됩니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M