C. elegans Ensaio de Quimioterapia: Um método para testar a quimioensation em worms

Overview

Este vídeo introduz quimiotaxis no nematode C. elegans e mostra um protocolo amostral testando a aversão quimotactica ao sulfato de cobre.

Protocol

O protocolo a seguir é um trecho de Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparação de Organismos Experimentais
   1. Escolha 10 nematoides encenados L4 por cepa 24 h antes de iniciar o ensaio para garantir que os organismos sejam adultos jovens quando testados. Para cada mutante ou nematoide de controle testado, escolha 10 L4s (10 para o controle e 10 para o ensaio).
      1. Mantenha os organismos L4 usando métodos padrão por 24 h em placas de ágar padrão semeadas com OP50 Escherichia coli. Se os organismos forem perdidos durante as etapas de lavagem subsequentes, compense aumentando o tamanho da amostra inicial (ou seja, escolha 20 vermes em vez de 10).
         NOTA: Comportamento é um fenótipo inatamente variável. Realize o método em triplicado para cada cepa em três dias separados. Inclua tensões de controle adicionais e condições para novas cepas, como destacado na seção de discussão.
   2. Imediatamente antes do ensaio, transfira organismos experimentais para uma placa de ágar sem bactérias e permita que nematoides se movam livremente por 1 minuto para remover bactérias em excesso.
      1. Se os organismos experimentais experimentarem condições de contaminação durante as 24 horas anteriores ao ensaio, descarte-os.
   3. Pipeta 1 mL de M9 na placa livre de bactérias para lavar vermes em um tubo de microcentrifuuge.
   4. Centrifugar a 3.000 x g por 1 min. Vermes devem formar uma pelota na parte inferior do tubo. Aspirar solução M9 sem interromper a pelota de worm. Adicione 1 mL de M9 à pelota de minhoca, tubo de invertido para misturar vermes com a solução.
   5. Repita os passos 1.4 mais três vezes.
      1. Se o excesso de bactérias foi inicialmente transferido com os vermes, repita por um total de 5 vezes. Nenhuma bactéria deve ser transferida para as placas de corrida de alimentos de cobre. Se o alimento for transferido para a placa de ensaio, ele interferirá com a coleta precisa de dados.
   6. Após a lavagem final, aspirar supernasce até 100 μL de M9 e a pelota de verme permanece.
      Atenção: Comportamentos relacionados à fome tornam-se evidentes após 30 minutos. Consequentemente, os vermes devem ser imediatamente transferidos da solução assim que as etapas de lavagem forem concluídas.
2. Preparação de placas de ensaio
   1. Prepare placas de ágar NGM padrão dois dias antes do ensaio.
      1. Se as placas forem mantidas em um ambiente úmido, faça placas de ágar 3 dias antes do ensaio. Alternativamente, remova a tampa da placa por 3 - 6 h para garantir o ressecamento adequado (se em um ambiente estéril).
   2. Com um marcador permanente espesso, faça uma linha na parte inferior da placa ao longo da borda externa e outra para formar uma barreira de linha média(Figura 1). A barreira da linha média deve ser equidistante de cada borda da placa. Use uma régua para garantir medidas precisas. Essas linhas servirão como guia na transferência de bactérias e da solução de cobre. Desde que a E. coli seja transferida antes da solução de cobre, essas linhas servirão como indicadores.
   3. Placa de semente com 50 μL de OP50 E. coli em apenas um lado da barreira de cobre para criar um gramado uniforme (Figura 2). A concentração bacteriana deve permanecer consistente entre os ensaios; no entanto, pouca variabilidade tem sido observada em resposta a leves diferenças de concentração.
      1. Use as linhas marcadas na parte inferior da placa para garantir que as bactérias não entrem em contato com a solução de cobre. Desde que a solução de cobre forra a borda da placa e forme uma barreira de linha média, transfira as bactérias para que a solução de cobre não entre em contato com a fonte de alimento.
   4. Marque um segundo conjunto de placas e não transfira OP50 E. coli para elas(Figura 2). Estas placas servirão para avaliar o controle negativo. Essas placas também devem ter uma marca em metade da placa para indicar a origem inicial da transferência.
   5. Deixe as bactérias secarem e incubar placas a 37 °C durante a noite. Certifique-se de que as manchas bacterianas não sejam perturbadas ao transferir para uma incubadora ou sala de 37 °C. Perturbação excessiva pode alterar a localização ou forma do patch de alimentos.
3. Ensaio de quimiotaxis
   1. Prepare recentemente uma solução de sulfato de cobre de 0,5 M (II) antes do tempo de início do ensaio. Desde que seja utilizado 125 μL da solução por placa, aumente este volume dependendo do número de placas de ensaio utilizadas (por exemplo, 5 placas de ensaio, 625 μL).
   2. Pipeta 100 μL da solução de sulfato de cobre (II) na borda do ágar para criar uma barreira de cobre externa. A parte inferior marcada da placa deve servir como guia.
   3. Pipeta 25 μL da solução de sulfato de cobre (II) para criar uma barreira de linha média.
      1. Certifique-se de que a solução de sulfato de cobre (II) não entre em contato com o patch bacteriano. O uso de uma técnica manchada, pois o streaking pode afetar a locomoção devido a recuos/arranhões no ágar.
   4. Deixe a solução de cobre secar na placa. O período de tempo pode variar dependendo das condições da placa e do laboratório. Verifique visualmente se há secura a cada 5 minutos após a transferência.
      NOTA: A solução de cobre exibe uma tonalidade azulada e é facilmente identificável. Use um tecido de laboratório para acarrrá-lo levemente a solução perto da borda da placa para discernir o ressecamento.
   5. Pipeta 20 μL da pelota de verme do fundo do tubo para a metade livre de bactérias da placa de ensaio.
      1. Certifique-se de que 10 vermes sejam transferidos para a placa de ensaio. Se vermes extras foram acidentalmente incluídos, remova-os colhendo com óleo de halocarbono para garantir que nenhuma bactéria seja adicionada à placa. Cada ensaio deve ter um número consistente de nematoides durante o ensaio.
         NOTA: Se poucos worms forem transferidos durante os ensaios, o aumento do tamanho inicial da amostra mitigará perdas potenciais durante lavagens e transferências.
   6. Remova o excesso de M9 da placa com um tecido de laboratório. M9 não deve entrar em contato com a solução de sulfato de cobre (II).
      Atenção: Certifique-se de que os vermes e a superfície do ágar não serão afetados durante a execução desta etapa. Se usado muito severamente, o tecido de laboratório pode criar recuos na superfície do ágar da placa e pode remover vermes. Os vermes removidos acidentalmente via KimWipe devem ser descartados.
   7. Uma vez que a solução M9 tenha sido removida e todos os worms tenham iniciado padrões locomotórios não líquidos, inicie o cronômetro de ensaio.
      1. O ideal é remover a solução M9 dentro de um minuto. O parâmetro essencial é a identificação da locomoção sinusoidal. Vermes locomotem de forma diferente, por exemplo, batendo em vez de sinusoidal, quando em líquido. Inicie o teste pare de assistir uma vez que cada um dos organismos experimentais pare de bater.
   8. Verifique as placas de ensaio a cada 30 minutos.
      1. Para as placas de ensaio com manchas bacterianas, escore positivamente os organismos se chegarem ao patch alimentar durante um período de 4h. Para as placas de controle negativas, escore positivamente organismos se eles cruzaram a barreira.

Representative Results

Figura 1: Uma Representação Visual de Marcas para Indicar a Colocação da Solução de Cobre na parte inferior de uma placa de Petri de 5 cm. Estas indicações são usadas para garantir que as seções da placa tenham sido adequadamente medidas e sirvam como diretriz ao transferir o patch bacteriano e, em seguida, solução de cobre para a superfície do ágar.

Figura 2: A placa de Petri de 5 cm é dividida em duas seções para placas de ensaio alimentar e um gramado bacteriano é formado no Centro de Uma dessas Seções para o Prato On-food. O patch de alimentos não deve entrar em contato com o composto de teste que reveste as bordas da placa e forma uma barreira de linha média.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]			Produced in lab
Cupric Sulfate	Sigma	C-1297	Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M