C.エレガンス 移動追跡: ワームにおける移動を評価する方法

Overview

このビデオでは、ビデオおよびトラッキング ソフトウェアを使用して、アリーナでのワームの動きを記録する方法について説明します。 このプロトコルの例は、ワーム移動に対するエタノール暴露の影響を測定します。

Protocol

以下のプロトコルは、デイヴィスら、カエノハブディティス・エレガンスのロコモーション速度に対するエタノールの影響を測定するためのアッセイ、J.Vis.Expからの抜粋である。(2015). 

1. アッセイ前日に実行する手順

   1. Op50大腸菌の芝生を播種した新鮮な線虫増殖培地(NGM)プレートにL4ステージワームをピックし、20°CO/Nで培養します。各アッセイ条件には10個のワームが必要です。ワームのO /Nの損失を可能にするためにワームの過剰を選びます。
      1. 初日の成人であるアッセイ動物のみ;多くの変異体は、野生のタイプよりも遅い速度で成長します。試験されたすべての動物が初日の成人になるように、発達の遅れを持つ株のピッキングのタイミングを調整します。
2. アッセイの日に実行する手順
   1. アッセイの準備:
      1. 標準のシードなし60 x 15 mm NGMプレートでアッセイを実行します。37°Cで使用するすべてのプレートを蓋を切り取って2時間乾燥させます。実験試験のそれぞれについて、4枚の乾燥したNGMプレートを使用します。これらは、0 mMおよび400 mMのエタノールアッセイプレートとそれに付随する順応プレートになります。
         注: NGMプレートの使用はここで重要です。プレートの組成の違い、特にそれらの浸透圧は、行動に対するエタノールの用量応答に強く影響を及ぼし得るが、これは、少なくとも部分的には、動物によって蓄積されるエタノールの量の変化によるものである。NGM寒天は160mOsmです。
      2. 乾燥後、アッセイに使用する各未播のNGMプレートの重量を量り、重量に注意してください。空のプレートの重量に基づいてプレート内のメディアの量を決定します。寒天の重量を体積に近づけるため、メディアの重量は同量の水と同じであると仮定します。
         注: 当社の最も一貫した結果は、元の10ml体積が8.3〜8.9mlの乾燥後の体積を有することを十分に脱水したNGMメディアで発見された。2時間の乾燥時間に代わるものは、プレートがこの容積範囲に達するまで乾燥して、インキュベーターの違いを考慮することです。
      3. 各プレートの表面に4個の銅リング(1.6cmの内径)を溶かして、異なる遺伝子型またはワームの治療群のコラルとして作用します。各リングを鉗子でつかみ、炎の中で熱を入れ(ブンゼンバーナーの強い炎がうまくいきます)約3秒間。リングを鉗子で保持したまま、すぐにリングをプレートの上に置き、「スキップ」するのを防ぎます。
         1. リングの複数のポイントで鉗子を軽く押し下げて、リングが寒天の表面に対して平らに保つことを確認します。リングを配置する際には、追加の3つのリングのためのスペースを残すように注意してください。
         2. 3つの追加の銅リングをプレートの表面に溶かし、4つすべてがカメラの視野になるようにできるだけ近くに置くように注意してください。
            注: 寒天で良いシールを作ることは、アッセイ中にリングにワームを保つために不可欠です。プレートの上を飛び回るリングは寒天で正しいシールを作る可能性は低く、寒天を傷つける可能性があり、ワームが巣穴を掘り起こし、ワームの視覚化を妨げる可能性があります。
         3. 各アッセイプレートに対して、乾燥して播種しない必要があり、エタノールを受け取らない「順応」プレートを用意します。これらのプレートに4つの銅リングを置きます。
      4. リング自体の視野に書かないように注意して、リングで使用されるワーム株で各リングの横のプレートの底にラベルを付けます。アッセイプレートのラベルを、付属の順応プレートと一致させます。
      5. 各アッセイプレートに加える100%エタノールの量を計算し、最終濃度が0mMまたは400mMエタノール(重量〜体積)になるようにします。実験ごとに(n = 1)、1つの0 mMと1つの400 mMエタノールプレートがあります。順応プレートはエタノールを受け取りません。エタノールを加え、プレートの表面の周りにピペットします。実験室用フィルムを使用してプレートを密封し、ベンチトップで2時間平衡化します。
      6. 1.5時間経過したら、アッセイの順応ステップ、ステップ2.2を開始します。
   2. 移動アッセイを実行する: アッセイプレート
      1. 各実験群の10個のワームを順応プレート上の銅リングの中心に慎重に移す。この時点で寒天に見える食品を取り除き、ワームピックで優しく削ります。実験の間で同じ株が同じ順序でプレートに置かないように、実験実験の試験を通して、実験グループがプレートに置かれている順序を変えます。
         注: 目標は、順応プレート上の食品がアッセイプレートに移された場合、ワームが食物の周りに凝集し、移動に対する薬物の影響が隠されるため、最小限の量の食品で動物をプレートに移すためです。
      2. これはワームが穴を掘ることを可能にし、アッセイを混乱させるので、ピックで寒天の表面を壊さないように注意してください。RTでワームを30分間インキュベートします。
      3. 各プレートの開始間隔が適切であることを確認します。経験豊富な実験者は40匹の動物、10匹のリングを<1.5分で4輪移動できますが、2分までの間隔は許容されます。標準的なアッセイは0 mMおよび400 mMエタノールの露出の10-12分および30-32分の露出の記録をする映画を有する。
      4. 2番目のムービーが開始する前に、約2分と30秒離れた400 mM露光のための順応プレートと400 mM露光の順応プレートを開始します。
      5. 30分順応期間後、順応プレートからアッセイプレートにワームを移します。各プレートの完成までのタイミングを追跡しながら、順応プレートに追加されたのと同じ順序で、ワームをアッセイプレート(0 mMまたは400 mMエタノール)に移します。蒸発にエタノールの損失を最小限に抑えるために実験室のフィルムでプレートを密封します。
      6. 薄いエッジの平らなワームピックでスクープモーションを使用して、平らにされたピックの上にワームを収集します。種なしの順応プレートからアッセイプレートへのワームの転送を細菌を使用せずに実行し、ワームをピックに接着するのに役立つため、ワームの移送に一般的に使用されます。
         注: プレート上の最初のワームは、プレートに追加された最後のワームよりも長くエタノールにさらされ、以前の時点では時間に依存する影響が現れるため、この段階で動物が移動する速度は非常に重要です。これは、実験複製全体で最初にプレート上に置かれる株を回転させる主な理由です。
   3. ロコモーションアッセイを実行する:撮影
      1. 0.5x顕微鏡の目的、0.8倍の倍率、2048x2048 7.4 μmピクセルCCDのカメラなど、視野(約42x42 mm²平方)の4つのリングすべてを同時にイメージングできる顕微鏡/カメラの組み合わせを使用します。
      2. 視野全体のイルミネーションを使用し、強度しきい値ステップでのオブジェクト認識に役立ちます。3 "x3" バックライトがうまく機能します。
      3. 従来の顕微鏡透過光源と比較してバックライトを使用すると失われるコントラストを生成するプレート配置されたメディア側の上(蓋を下ろす)上にワームを画像化します。
      4. 画像解析ソフトウェアを準備して、移動中のワームのタイムラプスムービーをキャプチャします。12 ビットのグレースケールイメージを 1 秒ごとにキャプチャするようにソフトウェアを設定します(2 分(120 フレーム)のムービー)。十分な画像解像度を維持したまま、出力ファイルのサイズを小さくするには、2x2 ビニングモードを使用して 1024x1024 ピクセルの画像をキャプチャします。
      5. 映画を録画します。最後のワームをそのプレートに置いた後、10分の120フレームの120フレームのムービーを記録し始める。ムービー ファイルを保存します。
      6. 第2プレート(400mMエタノール)を記録する。最後のワームが最初のプレート(0 mMエタノール)に置かれた後、両方のプレートに対してこのプロセスを繰り返し、各暴露の30〜32分の時間ポイントをキャプチャします。
         注: 解析対象の次のプレートの記録を開始する前に、キャプチャセッションのたびに画像ファイルを保存するのに十分な時間を確保します。
      7. アーカイブされた映画の将来の証拠と、これらの映画を開いて、他のパブリックドメインのオープンソースイメージングソフトウェアプログラムによって分析できるように、ImageJなど、各映画のコピーを8ビット256グレースケールTIFFファイルに変換します。
         注: ここで説明する画像解析ソフトウェアは、独自のファイル形式を使用します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.